Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Eignung des Nass - Trockentupfer Verfahrens (NTT) DIN 10113; 1997-07
zur Bestimmung des Hygienestatus in Melkanlagen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Florian Pfannenschmidt
aus Adensen
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann
1. Gutachter: Univ. -Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Gunter Amtsberg
„Wissenschaft ist Irrtum auf den letzten Stand gebracht.“
Linus Carl Pauling (1901 – 1994)
Gewidmet meiner Mutter
INHALTSVERZEICNIS
Seite
1. EINLEITUNG... 1
2. SCHRIFTTUM... 3
2.1 Melkanlage... 3
2.1.1 Bedeutung des Hygienestatus in Melkanlagen... 3
2.1.2 Einfluss der Melkanlage auf den bakteriologischen Status der Rohmilch... 4
2.1.3 Ursachen hygienischer Mängel in Melkanlagen... 7
2.1.4 Zitzenformschlauch ... 11
2.1.5 Reinigung und Desinfektion von Melkanlagen... 12
2.1.6 Mikrobiologische Bedeutung der Rohmilchkühlung ... 16
2.2 Beurteilung des mikrobiologischen Hygienestatus in Melkanlagen... 17
2.2.1 Indikatorkeime ... 17
2.2.1.1 Pseudomaden ... 17
2.2.1.2 Enterobacteriaceae ... 18
2.2.1.3 Hefen ... 18
2.3. Methoden zur mikrobiologischen Untersuchung von Oberflächen ... 19
2.3.1 Destruktive und nicht-destruktive Methoden... 19
2.3.1.1 Abstrich- oder Abwischverfahren mit Tupfern... 20
2.3.1.2 Abdruck- oder Abklatschmethoden... 24
2.3.1.3 Abspül- oder Abschwemmverfahren... 25
2.3.2 Nass-Trockentupfer Verfahren (NTT)... 25
2.3.2.1 Tupferproben aus Melkanlagen zur Überprüfung des hygienischen Status ... . 26
2.3.3 Mikrobiologische Untersuchung der Proben ... 27
2.3.3.1 Prinzip der Keimzahlbestimmung mittels Tupferproben... 27
2.3.3.2 Prinzip der Keimzahlbestimmung in flüssigen Substraten ... 28
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN... 30
3.1 Material... 30
3.1.1 Vorversuch... 30
3.1.1.1 Werkstoffe für die Kontamination mit Mikroorganismen... 30
3.1.1.2 Technische Mittel... 30
3.1.1.3 Mittel zur Probenentnahme ... 31
3.1.1.3.1 Tupfer... 31
3.1.1.3.2 Spülproben... 31
3.1.1.4 Mittel für mikrobiologische Ansätze ... 31
3.1.1.4.1 Verdünnungs- und Nährlösungen... 31
3.1.1.4.2 Keimarten... 31
3.1.1.4.3 Mikrobiologische Nährböden ... 32
3.1.2 Feldversuch ... 32
3.1.2.1 Milcherzeugerbetriebe... 32
3.1.2.2 Technische Mittel... 32
3.1.2.3 Labortechnische Hilfsmittel für den Feldversuch... 33
3.2. Methoden... 33
3.2.1 Vorversuch... 33
3.2.1.1. Arbeitstechnik mit dem modifizierten Nass-Trockentupfer (NTT) 33
3.2.1.2 Arbeitstechnik mit dem Trockentupfer (TT) ... 34
3.2.1.3 Arbeitstechnik für Spülproben (SP)... 34
3.2.1.4 Bestimmung des Keimgehaltes nach dem Guss- und Oberflächenverfahren ... 34
3.2.1.4.1 Probenvorbereitung ... 35
3.2.1.4.2 Kultivierung der Keimarten für die Kontaminationsversuche ... 35
3.2.1.4.3 Nährböden und Bebrütungszeit... 36
3.2.1.4.3.1 Staphylokokken und Streptokokken ... 36
3.2.1.4.3.2 Escherichia coli ... 36
3.2.1.4.3.3 Pseudomonas aeruginosa ... 36
3.2.1.5 Auswertung und Berechnung der Keimzahl ... 36
3.2.1.6 Kontaminationsversuche ... 37
3.2.1.6.1 Keimzahlbestimmung auf Oberflächenmaterialien... 37
3.2.1.6.2 Keimausbeute der Tupfer in Abhängigkeit von der Auswalkzeit. 38
3.2.1.6.3 Einflüsse der Faktoren Zeit, Temperatur und Keimart auf die Tupferproben... 38
3.2.2 Feldversuch ... 39
3.2.2.1 Probenentnahme in der Melkanlage... 39
3.2.2.1.1 Tupfer... 39
3.2.2.1.2 Milchproben ... 40
3.2.3 Überprüfung des Reinigungsautomaten ... 40
3.2.4 Mikrobiologische Bearbeitung der Tupfer- und Milchproben ... 41
3.2.4.1 Bestimmung des Keimgehaltes ... 41
3.2.4.2 Bearbeiten der Tupfer ... 41
3.2.4.3 Bearbeiten der Milchproben... 41
3.2.4.4 Auswertung und Berechnung der Keimzahl ... 41
3.3 Auswertung ... 42
3.3.1 Statistik ... 42
3.3 Untersuchungsergebnisse... 43
3.3.1 Untersuchungsergebnisse der Methode/Vorversuche ... 43
3.3.1.1 Wiederholbarkeit und Wiederfindungsrate bakteriologischer Befunde unter Verwendung von definierten Tupfern. ... 44
3.3.1.2 Überprüfung der Wiederholbarkeit und Wiederfindung abhängig von Keimart, Konzentration, Probenentnahmetechnik und Material 50 3.3.2 Feldversuch ... 62
3.3.2.1 Stufenkontrolle in den Milcherzeugerbetrieben ... 63
3.3.2.1.1 Kategorie 1... 64
3.3.2.1.2 Kategorie 2... 70
3.3.2.1.3 Kontrolle der Reinigungs- und Desinfektionsmittellösung [R/D] für
die Melkanlage in 33 Milcherzeugerbetrieben ... 78
3.3.2.1.4 Tupferung von unterschiedlichen Melkzeugen in 28 Betrieben ... 79
3.3.2.1.5 Chancenanalyse auf der Basis von Betriebsfragebögen... 81
3.3.2.2 Chancenanalyse auf der Basis der Messwerte in Kategorie 1 und 2 ... 83
4. DISKUSSION... 89
4.1 Intention der Untersuchung... 89
4.1.1 Vorversuch... 90
4.1.1.1 Einflussfaktoren... 90
4.1.1.2 Aussagekraft der Methode ... 92
4.1.1.3 Einfluss der Oberflächenbeschaffenheit auf das mikrobiologische Ergebnis ... 95
4.2 Feldversuch... 96
4.2.1 Kriterien der Betriebseinteilung ... 96
4.2.1.1 Praktische Aspekte bei der Probenentnahme in Melkanlagen.... 97
4.3 Beurteilung der Hygienestatus in Melkanlagen... 98
4.3.1 Stufenkontrolle ... 98
5. ZUSAMMENFASSUNG... 106
6. SUMMARY... 108
7. LITERATURVERZEICHNIS... 110
8. ANHANG... 138
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abb. = Abbildung
ABW = acided boiling water anschl. = anschließend
Aus = Ausschleusung (1. Aus)
AWZ = Auswalkzeit
B 1 = Becher 1
B 2 = Becher 2
BGBl. = Bundesgesetzblatt CIP = cleaning in place
cm = Zentimeter
Diff. = Differenz
DIN = Deutsches Institut für Normung e.V.
DLG = Deutsche Landwirtschaftliche Gesellschaft DVG = Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft et al. = et alii = und andere
Fa. = Firma
g = Gramm
GSP = Glutamat-Stärke-Phenolrotagar
ges. = gesamt
h = Stunden
HGC = Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agar I. E. = Internationale Einheiten
KbE = koloniebildende Einheiten
KS. = Kontaminationssuspension
KNM = Kein Nachweis möglich
LM = langer Milchschlauch
LMBG = Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz
log = dekadische Logarithmus
log Dek. = logarithmisches Dekrement (logarithmische Abnahme) LUFA = Landwirtschaftliche Untersuchungs- und
Forschungsanstalt
min = Minute
ml = Milliliter
MVO = Milchverordnung
n = Anzahl
Neo = Neopren
NTT = Nass-Trockentupfer Verfahren
p = Wahrscheinlichkeitswert (95% Niveau)
PC = Plate Count Agar
RE = Reinigungserfolg
±sd = Standardabweichung
Sek./sek. = Sekunden
*/:sf = Streufaktor
Sil = Silikon
SM = Sammelstück
SP = Spülprobe
TT = Trockentupfer
TnM = Tankmilchprobe nach Melkbeginn TvM = Tankmilchprobe vor Melkbeginn u. a. = unter anderem
UHT = ultrahocherhitzt VRB = Violet-Red-Bile Agar VK = Variationskoeffizient
Wdh. = Wiederholung
Wdfr. = Wiederfindungsrate Xa = arithmetischer Mittelwert Xg = geometrischer Mittelwert
Z = Lagerungszeit
z. B. = zum Beispiel
Zeichenerklärung
> = kleiner
< = größer
= = kleiner oder gleich
= = größer oder gleich
% = Prozent
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Nr. Titel Seite
1 Grundlagen der Biofilmbildung ... 6 2 Schemata von Toträumen und Milchrückständen in Rohrleitungen
(COUSIN u. MACKINNON, 1977) ... 8 3 Hygieneschwachstellen in einer Rohrmelkanlage
(COUSIN u. MACKINNON, 1977) ... 9 4 Darstellung einer Zirkulationsleitung
(COUSIN u. MACKINNON, 1977) ... 15 5 Darstellung der Kochendwasserreinigung
(COUSIN u. MACKINNON, 1977) ... 16 6 Wiederfindung (KbE/ml) von S. aureus nach 24 h Lagerung
der Tupfer bei Temperaturen von 22 °C und 5 °C ... 46 7 Einfluss der Lagerzeit [h] auf die Abnahme der Wiederfindung
[KbE/ml] beimpfter Tupfer für eine Lagertemperatur von 5 °C ... 49 8 Einfluss der Wiederbefeuchtung auf die Wiederfindung [KbE/cm2]
mit dem NTT, TT und SP-Verfahren für Neopren- und
Silikonoberflächen... 54 9 Wiederfindungsrate mit dem NTT Verfahren für verschiedene
Oberflächen und Keimarten... 61
TABELLENVERZEICHNIS:
Nr. Titel Seite
1 Betriebsdauer eines Zitzenformschlauches nach Literaturangaben 12 2 Zum Rückstandsverhalten von Milchinhaltsstoffen auf festen
Oberflächen
13
3 Prinzip der Reinigung und Desinfektion einer Melkanlage 13 4 Den Reinigungserfolg (RE) determinierende Faktoren 14 5 Übersicht von nicht-destruktiven und destruktiven Methoden 20 6 Prozentuale Wiederfindung der Keime nach Anwendung
verschiedener Tupferverfahren nach Literaturangaben
23
7 Anzahl untersuchter Tupferproben aus Melkanlagen (LUFA Nord/West 1999 – 2201)
27
8 Einfluss der Auswalkzeit (AWZ) der mit Staphylococcus aureus beimpften Tupfer
44
9 Vergleich der mittleren Wiederfindungsrate von Staphylococcus aureus unter Berücksichtigung der Auswalkzeiten.
45
10 Einfluss der Lagerungstemperatur auf die Keimisolierung der mit Staphylococcus aureus beimpften Tupfer. (6000/KbE/0,1 ml)
45
11 Einfluss der Lagerungszeit (Z) auf die Wiederfindungsrate definiert beimpfter Tupfer bei 5 °C Lagertemperatur.
47
12 Vergleich der Wiederfindungsrate für Staphylococcus. aureus für unterschiedliche Lagerungszeiten (Wilcox –Test)
49 13 Vergleich der Wiederfindungsrate für Escherichia coli. für
unterschiedliche Lagerungszeiten (Wilcox –Test)
49
14 Vergleich der Wiederfindungsrate für Pseudomonas aeruginosa für unterschiedliche Lagerungszeiten (Wilcox –Test)
50
15 Vergleich der Wiederfindungsraten (KbE/cm2) von Staphylococcus aureus auf Neo- und Sil- Oberflächen mit den Probenentnahme- techniken NTT, TT, (n = 20 Wiederholungen mit je zwei
bakteriologischen Ansätzen)
50
16 Vergleich der Wiederfindungsraten (KbE/cm2) von Staphylococcus aureus auf Neo- und Sil- Oberflächen mit den Nachweismethoden NTT, SP (n = 20 Wiederholungen mit je zwei bakteriologischen Ansätzen)
51
17 Vergleich der Wiederfindungsrate für die Variablen Material
(Neo/Sil) und Verfahren (NTT/TT) mit einer Staphylococcus aureus Kontaminationskonzentration von ca. 105KbE/ml (t-Test für
unabhängige Variablen)
52
18 Vergleich der Wiederfindungsrate für die Variablen Material (Neo/Sil) und Verfahren (NTT/SP) mit einer Staphylococcus aureus Kontaminationskonzentration von ca. 105KbE/ml (t-Test für unabhängige Variablen)
52
19 Einfluss der Wiederbefeuchtung der Sil- und Neo - Oberflächen mit sterilem Aqua dest. auf die mittlere Wiederfindungsrate (KbE/cm 2) von Stahphylococcus aureus für die angewendeten
Nachweisverfahren (t-Test für unabhängige Variablen)
53
20 Vergleich der Wiederfindungsraten der Methoden NTT/TT/SP und der Oberflächen Neo/Sil (t-Test für unabhängige Variablen)
54
21 Wiederfindungsrate mit 3 Keimarten (KbE/cm²) für die Verfahren NTT, TT und SP mit unterschiedlichen Keimkonzentrationen für die beiden Oberflächenmaterialien Neo und Sil.
55
22 Vergleich der Wiederfindungsrate für die Variablen Material
(Neo/Sil) und Verfahren (NTT/SP) mit einer Staphylococcus aureus Kontaminationskonzentration von 104KbE/ml ((t-Test für
unabhängige Variablen Nr. 1, Tab. 21).
57
23 Vergleich der Wiederfindungsrate für die Variablen Material (Neo/Sil) und Verfahren (NTT/SP/TT) mit einer Staphylococcus aureus Kontaminationskonzentration von 106 KbE/ml ((t-Test für unabhängige Variablen Nr. 2, Tab. 21)
58
24 Vergleich der Wiederfindungsrate für die Variablen Material (Neo/Sil) und Verfahren (NTT/SP/TT) mit einer Streptococcus
agalactiae Kontaminationskonzentration von 105 KbE/ml ((t-Test für unabhängige Variablen Nr. 3, Tab. 21).
59
25 Wiederfindungsrate [KbE/cm2] mit dem NTT Verfahren für verschiedene Oberflächen. (Antrocknungszeit = 2 Minuten)
60
26 Vergleich der Wiederfindungsrate von S. aureus und E. coli auf den Oberflächenmaterialien Neopren neu/alt, Glas, Stahl (t-Test für unabhängige Variablen)
61
27 Gruppeneinteilung der Proben aus dem Sammeltank nach Molkerei- und eigenen Untersuchungsergebnissen
62
28 Probenentnahmeart und Kontrollpunkte der Stufenkontrolle in den Milcherzeugerbetrieben.
63
29 Aerobe Gesamtkeimzahl für die Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten I - VII auf PC Agar
64
30 Vergleich der Wiederfindungsrate der Gruppen 1 bis 4 an den sieben Kontrollpunkten (t-Test für unabhängige Variablen)
65
31 Gehalt an Hefen für Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten I – VII mit HGC Agar (t-Test für unabhängige Variablen)
66
32 Vergleich der Wiederfindungsrate der Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten I - VII (t-Test für unabhängige Variablen)
67
33 Coliforme Keime für die Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkte n I - VII auf VRB Agar
68 34 Vergleich der Wiederfindungsrate der Gruppen 1 bis 4 an den
Kontrollpunkten V –VII (t-Test für unabhängige Variablen)
69
35 Nachweis von Pseudomonaden für die Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten I - VII mit GSP Agar (t-Test für unabhängige Variablen)
69
36 Vergleich der Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten I – VII (t-Test für unabhängige Variablen)
70 37 Aerobe Gesamtkeimzahl für die Gruppen 1 bis 4 an den
Kontrollpunkten I - VII auf PC Agar
71
38 Vergleich der Wiederfindungsrate der Gruppen 1 bis 4 an den sieben Kontrollpunkten.
72
39 Korrelationskoeffizienten zwischen den Kontrollpunkten I – VII (PC Agar)
72
40 Gehalt an Hefen für Gruppen 1 – 4 an den Kontrollpunkten I – VII mit HGC Agar .
73
41 Vergleich der Wiederfindungsrate der Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten IV - VII (t-Test für unabhängige Variablen)
74
42 Korrelationskoeffizienten zwischen den Kontrollpunkten V-VII (HGC Agar)
74
43 Coliforme Keime für die Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten I - VII mit VRB Agar
75
44 Vergleich der Wiederfindungsrate der Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten I – VII (t-Test für unabhängige Variablen)
75
45 Korrelationskoeffizienten zwischen den Kontrollpunkten V – VII (VRB Agar)
76 46 Nachweis von Pseudomonaden (KbE/ml/ cm2) für die Gruppen 1bis
4 an den Kontrollpunkten I – VII mit GSP Agar
76
47 Vergleich der Wiederfindungsrate der Gruppen 1 bis 4 an den Kontrollpunkten V – VII (t-Test für unabhängige Variablen)
77
48 Korrelationskoeffizienten zwischen den Kontrollpunkten V – VII (GSP Agar)
77
49 Dosierungskontrolle der Reinigungsautomaten zu einer R/D- Kontrolllösung in den Gruppen 1 bis 4 für die Kategorien 1 und 2 (100 % = 0,5%ige R/D-Lösung)
78
50 Darstellung der prozentualen Annäherung des R/D Spülwassers der Reinigungsautomaten in den einzelnen Kategorien und den
Gruppen 1 bis 4 zur Kontrolllösung (100% = 0.5%ige R/D Lösung)
78
51 Vergleich der Melkbecher mit mikrobiologisch positiven und
negativen Ergebnissen für die Kategorien 1 und 2 in den Gruppen 1 bis 4
79
52 Vergleich der Melkbecher mit mikrobiologisch positiven Befunden (KbE/cm2)
80
53 Vergleich der Wiederfindungsrate der Melkbecher mit
mikrobiologisch positiven Ergebnissen in den Kategorien 1 und 2 für die Gruppen 1 bis 4 (t-Test für unabhängige Variablen)
80
54 Hypothese 1 81
55 Hypothese 2 81
56 Hypothese 3 82
57 Hypothese 4 82
58 Hypothese 1 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
83
59 Hypothese 2 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
83
60 Hypothese 3 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
84
61 Hypothese 4 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
84
62 Hypothese 5 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
85
63 Hypothese 6 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
85
64 Hypothese 7 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
86 65 Hypothese 8 auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den
Kategorien (K) 1 und 2
86
66 Hypothese 9 und 9 A auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
87
67 Hypothese 10 und 10 A auf der Basis der erhobenen Betriebsdaten in den Kategorien (K) 1 und 2
88
1. EINLEITUNG
Entsprechend der Milchgüte-VO erfolgt in der Bundesrepublik Deutschland die Einteilung der Anlieferungsmilch in Güteklassen allein auf der Grundlage des
„Gütemerkmals“ Keimzahl. Monatlich sind mindestens 2 Untersuchungen der Anlieferungsmilch zur Feststellung der bakteriologischen Beschaffenheit durchzuführen. Für die Güteklasse 1 muss der geometrische Mittelwert der Keimzahlen über zwei Monate Befunde von < 100.000 Keime je cm3 Milch aufweisen. Geometrische Mittelwerte der Keimzahlen pro cm3 Milch von > 100.000 Keime werden in Güteklasse 2 eingestuft.
Wenngleich die mittlere aktuelle Keimzahl der Anlieferungsmilch in der Bundesrepublik Deutschland ca. 20.000 Keime pro ml Milch ausmacht, werden in einzelnen Milchtierherden Keimzahlbefunde ermittelt, die eine Größenordnung von bis zu Millionen Keime /ml Milch zeigen.
Die Keimzahl der Anlieferungsmilch wird in der Regel überwiegend durch die Sorgfalt für Reinigung und Desinfektion der Melkanlage und eine rasche und ausreichende Kühlung der Milch im Hoftank determiniert. Neben diesen Kriterien können weitere Faktoren wie Präzision der Melkhygiene, Hygienestatus der Melkanlage oder der Gesundheitsstatus der Milchtiere Einflüsse auf die Höhe der Keimzahl ausüben. Bei plötzlichen Änderungen der Keimzahlhöhe ohne ersichtliche Ursache muss auch an Fehler in Verbindung mit der Probenentnahme, Probentransport und -lagerung aber auch der Analytik gedacht werden.
Unter Feldbedingungen wird häufig aus Zeit- und Kostengründen versucht, mit Hilfe von Tupferproben aus der Melkanlage eine ursächliche Klärung für hohe Keimzahlwerte in der Anlieferungsmilch herbeizuführen. Nicht selten wird auch das Ergebnis von Tupferproben als Ausdruck für das in dem jeweiligen Milchtierbetrieb vorherrschende Spektrum der Mastitiserreger angesehen.
Bislang bestehen keine weder national noch international akzeptierte Regeln oder Empfehlungen für die Interpretation von Ergebnissen aus Tupferproben einer Melkanlage. Die Aussagefähigkeit von Tupferprobenuntersuchungen unterliegt einer hohen Variabilität bedingt durch Einflussfaktoren wie Art der Tupfer, Trocken- oder
Nasszustand, Oberflächenstruktur der zu tupfernden Fläche , Probentransport und Untersuchungszeitpunkt (Zeitspanne zwischen Entnahme und laboranalytischer Untersuchung), etc. Somit ist kaum eine Standardisierung der Untersuchung von Tupferproben aus Melkanlagen gewährleistet.
Hier setzt die vorliegende Dissertationsschrift an, in der die Standardisierung von Tupferprobenentnahmetechniken und die Aussagefähigkeit von Untersuchungen von Tupferproben aus Melkanlagen unter besonderer Berücksichtigung des Nass- Trockentupfer Verfahrens untersucht werden soll.
Als Mitglied der Arbeitsgruppe Mastitisforschung der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurde mir von Herrn Prof. Dr. Dr. habil. Jörn Hamann die Bearbeitung folgender Fragestellungen übertragen:
1.) Vergleich der Probenentnahmeverfahren Nass-Trockentupfer, Trockentupfer und Spülprobe im Hinblick auf Einflussfaktoren wie Lagerungstemperatur, Auswalkzeit, Lagerzeit der Tupfer nach der Entnahme unter Berücksichtigung unterschiedlicher Materialen milchführender Oberflächen (Neopren, Silikon, Glas, und Stahl) und verschiedener Kontaminationskeime (S. aureus, Sc.
agalactiae, E. coli und P. aeruginosa).
2.) Einordnung und Bewertung des weitgehend standardisierten Nass- Trockentupfer Verfahrens
3.) Einsatz des modifizierten Nass-Trockentupfer Verfahrens in Milcherzeugerbetrieben zur Überprüfung von Praktikabilität und Aussagefähigkeit insbesondere im Vergleich mit Keimzahlbefunden aus Tankmilchproben.
2. SCHRIFTTUM 2.1 Melkanlage
Eine Melkanlage ist eine vollständige Einrichtung zum Melken von Kühen, Wasserbüffeln, Schafen und Ziegen oder anderen Säugetieren, die üblicherweise aus Vakuum - und Pulssystem mit einer oder mehreren Melkeinheiten besteht (DIN ISO 3918, 1998).
2.1.1 Bedeutung des Hygienestatus in Melkanlagen
Die fortwährende mikrobiologische Überwachung in den Bereichen der Lebensmittelgewinnung und Lebensmittelverarbeitung ist für die Qualität der Lebensmittel und damit für den Schutz des Verbrauchers von außerordentlicher Bedeutung (THRAN 1979).
Das Lebensmittel Milch sollte von der Erzeugung bis zum Konsum keine Beeinträchtigung der für den Genuss wesentlichen Eigenschaften erleiden, damit eine gesundheitliche Gefährdung des Verbrauchers ausgeschlossen werden kann (SUHREN et al 1980; SCHÄLLIBAUM 1983).
Oberflächen, die für die Behandlung, Bearbeitung oder Lagerung von Lebensmittel verwendet werden, sind Hauptquellen für mikrobielle Kontaminationen (FIRSTENBERG-EDEN 1981; WONG u. CERF 1995). Anhaftungen von Bakterien (Biofilmbildung) können zu einer ständigen Kontamination mit verderbnisrelevanten oder potentiell pathogenen Keimen führen (NORTERMANS u. KAMPELMACHER 1983; ASPERGER u. STÖHR 1996).
In einer sehr sauber ermolkenen Milch (< 104 KbE/ml) entfallen etwa die Hälfte der Bakterien aus der Milchdrüse, während der Rest der Mikroorganismen aus dem Zitzenkanalepithel und von den milchführenden Oberflächen der Melkanlage stammt (TOLLE u. WHITTLESTONE 1976; DESMASURES et al. 1997).
In der Verordnung über Hygiene und Qualitätsanforderungen an Milch und Erzeugnisse auf Milchbasis (MVO 1995) sind die Voraussetzungen für die Gewinnung von Rohmilch festgelegt. Dementsprechend wird in Anlage 4 der Richtwert der aeroben Gesamtkeimzahl im geometrischen Mittel über zwei Monate
bei mindestens zwei Probenentnahmen auf < 100.000 KbE/ml Milch festgesetzt. Die aerobe Gesamtkeimzahl ist das einzige Beurteilungskriterium zur Bewertung der hygienischen Beschaffenheit der Rohmilch (NOGAI u. WIESNER 1980; COENEN 1999; BRAUN u. FEHLHABER 2001). Der mittlere Keimgehalt in der Anlieferungsmilch liegt in Deutschland mit etwa 20.000 KbE/ml weit unter den gesetzlichen Anforderungen. Allerdings ist in den letzten 50 Jahren durch die Einführung der Tiefkühlung (6 °C) und die Verbesserung der Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen eine Verschiebung der Keimflora zugunsten der psychrotrophen Mikroorganismen festzustellen, die eine vermehrte proteolytische und lipolytische Aktivität aufweisen (BRAUN u. FEHLHABER 2001). Es herrscht Übereinstimmung, dass die Haltbarkeit der Rohmilch durch die bakterielle Aktivität in der Milch begrenzt wird (VON BOCKELMANN 1982).
2.1.2 Einfluss der Melkanlage auf den bakteriologischen Status der Rohmilch Der Keimgehalt der Rohmilch wird erfahrungsgemäß hauptsächlich durch die Sauberkeit der Gerätschaftsoberflächen bestimmt (TERPLAN et al. 1969). Die postsekretorische Kontamination der Rohmilch durch milchführende Oberflächen stellt die bakterielle Hauptkontaminationsquelle der Milcherzeug ung dar (KIELWEIN 1976; VON BOCKELMANN 1982). Der Keimgehalt in der Anlieferungsmilch wird somit durch den Zustand der Geräte für die Milchgewinnung und Aufbewahrung maßgeblich beeinflusst (MROZEK 1971; SPEERS u. GILMOUR 1985; GODEFAY u.
MOLLA 2000).
Wenn frische Rohmilch Koloniezahlen von einigen hunderttausend bis mehreren Millionen KbE/ml aufweist, beruht die Kontamination überwiegend auf Kontakt mit keimhaltigen Oberflächen (KANDLER 1964; MROZEK 1975; WINTERER 1982). Für eine Weiterentwicklung der gesetzlichen Vorschriften zur Güte-Einschätzung der bakteriologischen Beschaffenheit von Anlieferungsmilch könnte als Richtschnur die Anlage 9 zur MVO dienen, wobei für Vorzugsmilch eine aerobe Gesamtkeimzahl von 30.000 KbE/ml angegeben wird.
Die Ablagerungen von Milchbestandteilen auf den milchführenden Oberflächen wird als Biofilmbildung im Sinne eines dynamischen Prozesses beschrieben (WONG und CERF 1995):
1. Konditionierung der Oberfläche
Sobald ein flüssiges Medium mit einer Unterlage in Berührung kommt, werden verschiedene Moleküle an die Oberfläche herangetragen (ausgerichtet) und adsorbiert. Diese Bindungsvorgänge beruhen auf physikalischen, chemischen, kolloidalen, biochemischen und biologischen Kräften (LENGAUER 1981). Die mit diesem Film überzogenen Oberflächen wirken sich fördernd oder hemmend auf die sich anlagernden Mikroorganismen aus.
2. Transport und Haften von Keimen
Durch verschiedene Kräfte werden die in dem Medium befindlichen Mikroorganismen an die so vorbereiteten Oberflächen herangetragen. Dabei werden Keime in zwei Phasen absorbiert: einer reversiblen folgt eine irreversible Adsorption. In der reversiblen Adsorptionsphase beginnt der erste Haftprozess zwischen Keim und Substrat, der z.B. noch leicht durch Spülen aufgehoben werden kann.
Die reversible Phase wird durch den Einfluss unterschiedlicher chemischer und physikalischer Kräfte zu einer irreversiblen Adsorption, die nur noch mit stärkeren mechanischen Maßnahmen, wie z. B. Bürsten, unterbunden werden kann.
3. Keimwachstum und Biofilmentwicklung
Sind Keime irreversibel adsorbiert, beziehen sie ihre Nährstoffe aus dem Oberflächenfilm und der flüssigen Umgebung. So entwickeln sich Mikrokolonien, die sich durch die Produktion von extrazellulären, polymeren Substanzen (EPS) auf den Oberflächen verankern und einen Biofilm bilden. Zusätzliche anorganische und organische Substanzen können sich in diesem Biofilm ablagern und die Akkumulation von weiteren Keimen begünstigen und verstärken.
4. Ablösung des Biofilms
Im Zuge der Reifung des Biofilms können Keime individuell abgelöst oder abgeschilfert werden. Das kann durch die Wirkung von Scherkräften, die Gegenwart bestimmter Chemikalien in der Umgebungsflüssigkeit, sowie von veränderten
Oberflächeneigenschaften der Bakterien und durch Änderung des Substrats begünstigt werden. Freigesetzte Keime werden an andere Stellen transportiert und induzieren erneut eine Biofilmbildung. Biofilme sind keine statischen Strukturen und dehnen sich auf Oberflächen aus (AUSTIN u. BERGERON 1995).
In Abb. 1 sind die Faktoren und Zusammenhänge der Biofilmbildung nach ASPERGER u. STÖHR (1996) aufgeführt:
Reinigung und Desinfektion Sanitation
B I O F I L M
M E D I U M
Z u s a m m e n s e t z u n g ( F e t t , E i w e i ß , e t c . ) V e r w e i l b e d i n g u n g e n ( T e m p e r a t u r , Z e i t ) Oberfläche
- von Lebensmitteln -B e s c h a f f e n h e i t - v o n K o n t a k t o b e r f l ä c h e n - Art
- von Umweltoberflächen - Rauhigkeit
M ikroorganismen A d h e s i n e ,
ESP= extrazelluläre, polymere S u b
S u b s t a n z e n
Abb. 1: Grundlagen der Biofilmbildung
2.1.3 Ursachen hygienischer Mängel in Melkanlagen
Ursächlich für die Biofilmbildung kann der fehlerhafte Aufbau einer Melkanlage sein, wenn nämlich einzelne Bauteile z.B. Zitzenbecher-Spülvorrichtung, Milcheinlassstutzen in die Milchleitung, Gummiteile am Milchabscheider, Überlaufsicherung und Filter der Vakuumregeleinheit, Toträume und Rohrverzweigungen (siehe Abbildung 2 und 3) nur ungenügend mit Reinigungslösung gespült werden (COUSIN u. MACKINNON 1977, GRAßHOFF 1983, 1998, GRAßHOFF u. REINEMANN 1993). Ein weiterer Faktor für die Reinigungsfähigkeit liegt u.a. im Design (Form, Größe und Oberflächenbeschaffenheit des verwendeten Materials) der einzelnen Melkkomponenten (MROZEK 1983, IDF 1996, 2000). Eine Erweiterung der Melkanlage hinsichtlich einer Vergrößerung des Durchmessers von Rohrleitungen kann ebenfalls ein Grund für Schwierigkeiten bei der Reinigung sein, vor allem in Milchmengenmessgeräten, Sammelstücken, Milchflusssensoren und der automatischen Melkzeugabnahme (PALMER 1981; MARSHALL 1982, VON BOCKELMANN 1983, GRAßHOFF u. REINEMANN 1993). Problematische Materialien sind u.a. die Gummibestandteile einer Melkanlage (PALMER 1981).
Eine merkliche Beschleunigung in der Vermehrung von Mikroorganismen ist in Dichtungen und Kunststoffleitungen zu beobachten. So ist in 100 mg Schmutz eine Keimdichte vo n 108 KbE/mg vorhanden (GRÜN 1969, MROZEK 1983).
Milchführende Schläuche, die ein Jahr in Gebrauch sind, beeinflussen die Milchqualität nachteilig durch organische Bestandteile (z.B. Mikroorganismen und Weichmacher für Gummibestandteile), wodurch ein Wechsel nach sechs Monaten angezeigt ist (KIERMEIER et al 1969, RIEBER 1982, BLÜTHGEN 2000).
In Abbildung 2 sind strömungsbedingte Toträume (z. B. Milchabscheider und Blindendstücke) von Melkanlagen dargestellt, in denen sich Plaques bilden können.
In Abbildung 3 sind Hygieneschwachstellen einer Rohrmelkanlage aufgeführt:
Abb. 2: Schemata von Toträumen und Milchrückständen in Rohrleitungen (COUSIN u. MACKINNON 1977)
Abb. 3: Hygieneschwachstellen in einer Rohrmelkanlage (COUSIN u. MACKINNON 1977)
1. Zitzenbecher-Spülvorrichtung
2. Milcheinlassstutzen in die Milchleitung 3. Gummiteile am Milchabscheider 4. Überlaufsicherung
5. Filter der Vakuumregeleinheit
6. Dosierer des Reinigungs- und Desinfektionsmittels
Die Punkte 1 bis 6 in Abbildung 3 sind Beispiele für bautechnische Gegebenheiten in einer Melkanlage, in der sich z.B. der Innendurchmesser und das Material der milchführenden Oberflächen ändert und dadurch Reinigungsprobleme infolge einer Biofilmbildung entstehen können (siehe 2.1.3 und 2.1.2).
2.1.4 Zitzenformschlauch
Der Zitzenformschlauch ist die unmittelbare Nahtstelle zwischen dem technischen Aggregat Melkmaschine und dem biologischen, variablen und hochempfindlichen Organ Milchdüse. Damit hat er erheblichen Einfluss auf die Dauer des Milchentzuges, den Entleerungsgrad des Euters, die Erhaltung der Eutergesundheit und die Rohmilchqualität (MODEL u. RUDOVSKY, 1999). Veränderte Zitzenformschläuche, die nicht mehr den Vorgaben des Herstellers entsprechen oder einen niedrigen hygienischen Status besitzen, können Mastitiden stark begünstigen und einen nachteiligen Einfluss auf die Rohmilchqualität haben (PLASTRIDGE 1958, KIELWEIN 1966, KIERMEIER et al. 1968, JASPER u. DELLINGER 1975, RABOLD et. al. 1985, HAMANN 1989, BLÜTHGEN 2000).
Die Einlagerung von Fett in Gummiteile ist die Hauptursache für ihre Alterung, weil Triglyceride einen Weichmachereffekt besitzen und die Oxidation des Gummis fördern. Sowohl ultraviolette Strahlung, der Temperaturwechsel bei der Reinigung und Desinfektion, als auc h die chemische Zusammensetzung der Reinigungsmittel und die mechanische Beanspruchung beschleunigen den Alterungsprozess der Zitzenformschläuche. Ein destruktiver Effekt durch mikrobiellen Besatz von Gummi konnte nicht festgestellt werden (BERRIDGE 1951, GARDNER u. BRIDGES 1952, COOPER u. GARDNER 1953, ANDERSON u. COOMBS 1977, BLÜTHGEN 2000).
Elektronenmikroskopische Untersuchungen der Oberflächenstruktur von Gummi und Silikon ergaben, dass Gummioberflächen nach 1000 bis 5000 und mehr Melkungen Risse bekommen, in denen sich Mikroorganismen ansiedeln, während Silikon solche Veränderungen nicht aufwies (NOORLANDER u. HECKMANN 1980). Die oben genannten Gründe haben zahlreiche Autoren veranlasst, sich Gedanken zu der Betriebsdauer eines Zitzenformschlauches zu machen.
Tab.1: Betriebsdauer eines Zitzenformschlauches nach Literaturangaben
Autor Untersuchungsort Material
Empfohlene Wechselperiode nach
Autorenangabe
PAIZS (1974) k.A k.A 200 h
DROSCHA (1976) MA Neopren 400 h
SEMMLER (1975) MA Neopren 200 h
WENDT et al. (1998) k.A k.A 750 h
THIEME et al. (1975) k.A. k.A. 800 h
RUFFO u. SANGIORI (1976) Labor Neopren 1000 h
GUTHY (1970) MA Neopren
RABOLD et al. (1985) MA Neopren
DE KRUIF et al. (1998) k.A. k.A.
6 Monate k.A. : keine Angaben MA: Melkanlage in einem Milcherzeugerbetrieb
h: Betriebsstunden
2.1.5 Reinigung und Desinfektion von Melkanlagen
Die Gewinnung einer keimarmen Rohmilch setzt eine gründliche Reinigung mit anschließender Desinfektion der Melkanlage voraus (GUTHY 1995). Reinigung und Desinfektion sind zudem entscheidend für die Verringerung einer möglichen Rekontamination der Rohmilch mit Mikroorganismen. Voraussetzung hierfür sind die Entfernung von Milchinhaltsstoffen, Denaturierung (Abtötung) und Hemmung der Keime mit Hilfe von Reinigung und Desinfektion (MROZEK 1982). Eine desinfizierende Reinigung von Melkanlagen ist, unabhängig von Bauart und Hersteller, nach jeder Nutzung notwendig, um die nach Milch-Güteverordnung und Milchverordnung geforderte bakteriologische Beschaffenheit zu gewährleisten (PELZER et al. 1997). Die Rückstände auf den milchführenden Oberflächen lassen sich in Zucker, Fett, Protein und Mineralsalze einteilen (Tabelle 2) und haben somit ein unterschiedliches Verhalten gegenüber den Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen (GRAßHOFF 1998). Aufgrund variierender chemischer und physikalischer Eigenschaften der Milchrückstände auf festen Oberflächen ist eine Durchführung der Reinigung und Desinfektion in vier Schritten in Tabelle 3 zusammengefasst, die als grundsätzlich einzusetzendes Prinzip verstanden und vielfach modifiziert werden kann (TOLLE u. WHITTLESTONE 1976, IDF 1997).
Tab. 2: Zum Rückstandsverhalten von Milchinhaltsstoffen auf festen Oberflächen
Lößlickeit der Komponente Komponente
auf der
Oberfläche Wasser Alkalisch Sauer
Schwierigkeitsgrad der
Ablösung Temperaturerhöhung
Zucker +++ - - leicht Karamelisierung:
schwer zu reinigen
Fett - +++ - schwer Polymerisation:
schwerer zu reinigen Eiweiß - +++ + sehr schwer Denaturierung: sehr schwer zu reinigen Mineralsalze ++ + +++ leicht bis schwierig generell einfach zu
reinigen
+++: sehr gut; ++: gut; +: mäßig; -: unlößlich
Tab. 3: Prinzip der Reinigung und Desinfektion einer Melkanlage 1. Vorspülen mit klarem Wasser
2. Reinigung 3. Desinfektion
4. Nachspülen mit Trinkwasserqualität
Ø Im Allgemeinen werden die Arbeitsgänge 2 und 3 gleichzeitig durchgeführt.
Das Vorspülen einer Melkanlage mit Trinkwasser ist schon Teil der Reinigung, weil dadurch bereits ein Großteil der Nährstoffe für die Keimvermehrung entfernt und die Anzahl der vorhandenen Mikroorganismen um zwei Zehnerpotenzen verringert wird (MROZEK 1975, THIEL 1977, WIESNER u. HUMPKE 1972, PESCHEK 1982). Um Fettreste aus der Melkanlage zu lösen, sollte möglichst das Vorspülwasser eine Temperatur von max. 30 °C haben. Die Reinigung und Desinfektion soll durch DLG – geprüfte Reinigungs- und Desinfektionsmittel in korrekter Konzentration (ca. 0,5%ig, nach Herstellerangabe) bei einer Temperatur von ca. 60 °C mit einer Einwirkungsdauer von mindestens 15 Minuten erfolgen. Von Melkzeit zu Melkzeit soll zwischen alkalischen und sauren Chemikalien gewechselt werden, weil dadurch
sowohl die Reinigung verbessert als auch die Resistenzbildung von Mikroorganismen verzögert werden. In der Regel werden für eine Menge von 10 Litern Gebrauchslösung rund 50 ml eines konzentrierten alkalischen oder sauren Mittels benötigt (ORDOLFF 1995). Vier Faktoren bestimmen den Reinigungserfolg, sie sind in Tabelle 4 zusammengefasst (RESCH u. GUTHY 1999, 2000).
Tab. 4: Den Reinigungserfolg (RE) determinierende Faktoren 1 Chemie [C] Reinigungswirkung
2 Mechanik [M] Turbulenzen
3 Temperatur [T] steigende Einwirkungstemperatur 4 Zeit [Z] Einwirkungszeit
Der Reinigungserfolg (RE) lässt sich als eine Funktion der angeführten Parameter beschreiben :
RE = f (C, M, T, Z) = const.
Der Reinigungserfolg ergibt damit eine konstante Größe, die mit jedem Vorgang erreicht werden muss.
Rohrmelkanlagen, Melkstände und Recorder-Melkanlagen werden mit der CIP - (Clean In Place-) Methode gereinigt und desinfiziert. Mit dieser Form der Reinigung und Desinfektion werden die Oberflächen von Melkanlagen nur durch Zirkulation und/oder fließende chemische Reinigungslösungen und Wasserspülungen mechanisch gereinigt (IDF 1996, 2000).
Es werden zwei CIP -Methoden angewendet, zum einen die Zirkulationsreinigung und zum anderen die Kochendwasserreinigung. Bei der Zirkulationsreinigung wird eine Melkanlage in drei Phasen gespült. In der ersten Phase erfolgt eine Vorspülung mit lauwarmem Wasser. Anschließend wird für ca. 15 Minuten eine zirkulierende Heißspülung (50 – 60 °C) mit einem Desinfektionsmittel vorgenommen und zum Schluß folgt eine Kaltwasserspülung, um Reinigungs- und Desinfektionsmittelreste zu entfernen (COUSINS u. MACKINNON 1977). Die Spülphasen werden von einem Automaten gesteuert (siehe Abbildung 4). Für diese Reinigungsautomaten wurden die unterschiedlichsten Zeitpläne der einzelnen Spülphasen entwickelt (ROHLEDER
1970, TERPLAN 1972, WIESNER u. HUMPKE 1972). Aus ökonomischen Gründen und zur Schonung des Materials wird in der Bundesrepublik Deutschland gegenwärtig überwiegend die Zirkulationsreinigung eingesetzt (AUMANN et al. 1993, ORDOLFF 1995).
Die Kochendwasserreinigung beruht auf dem Prinzip der Hitzedesinfektion. In einem Wasserboiler wird das Wasser auf 96 °C erhitzt und teilweise mit Säuren versetzt, um die Reinigung zu unterstützen und gleichzeitig eine Verkalkung der Heizstäbe zu verhindern. Für eine wirksame Reinigung und Desinfektion müssen alle Bauteile der Melkanlage für mindestens zwei Minuten eine Temperatur von 77 °C erreichen (siehe Abbildung 5) (COUSIN u. MACKINNON 1977, PALMER 1981, HAMANN 1990, SCHRÖPEL u. FICKEL 1992).
In den Abbildungen 4 und 5 wird das Prinzip einer Zirkulations- bzw.
Kochendwasserreinigung von Melkanlagen dargestellt. Die Pfeile zeigen die Fließrichtung der R-/D Lösung an.
Abb. 4: Darstellung einer Zirkulationsreinigung (COUSIN u. MACKINNON, 1977)
Abb. 5: Darstellung der Kochendwasserreinigung (COUSIN u. MACKINNON 1977)
2.1.6 Mikrobiologische Bedeutung der Rohmilchkühlung
Der Zweck der Rohmilchkühlung nach dem Melken besteht darin, einen befriedigenden bakteriologischen Status aufrechtzuerhalten (HOYLE 1977). Die bakteriologische Beschaffenheit der Rohmilch kann durch eine nicht sachgerechte Lagerung nachteilig beeinträchtigt werden (FLÜCKINGER 1981, IDF 1995, GODEFAY u. MOLLA 2000). Die Entwicklung einer elektrischen Kühltechnik für die Milcherzeugerbetriebe hat die Haltbarkeit der Milch wesentlich verlängert, indem sie die Rohmilch so schnell wie möglich von Körpertemperatur (37 °C) auf 4 °C herunterkühlt (KIURU et al. 1971, VAN DEN BERG 1981).
In der MVO (1995) ist in Anlage 3 genau definiert, dass Milch, die nicht innerhalb von 2 Stunden abgegeben wird, im Falle der täglichen Abgabe auf eine Temperatur von min. 8 °C und bei nicht täglicher Abgabe auf min. 6 °C heruntergekühlt werden muss. Die Zusammensetzung der in der Rohmilch vorhandenen Mikroorganismen wird durch die Kühlung beeinflusst, indem eine Verschiebung von vorwiegend
grampositiven, mesophilen, milchsäurebildenden und reduzierenden Keimen zu einer gramnegativen, psychrotrophen, proteolytisch, lipolytisch und nicht reduzierenden aktiven Keimflora stattfindet (WITTER 1961, MÜNCH 1968, THOMAS u. THOMAS 1973, MACKENZIE 1973, O´CONNOR 1981, COUSIN 1982, DESMASURES 1997, VILJOEN 2001).
2.2 Beurteilung des mikrobiologischen Hygienestatus in Melkanlagen
2.2.1 Indikatorkeime
Der Begriff „Indikatorkeim“ findet Anwendung für Keime, die bei unsachgemäßer Behandlungsweise oder Rekontamination des entsprechenden Lebensmittels auftreten (MOSSEL 1978). Der Nachweis dieser Keime sollte für die mikrobiologische Erfolgskontrolle im Rahmen der Guten Herstellerpraxis (GHP) einfach und schnell zu führen sein. Die Auswahl gut definierter Keimarten hinsichtlich ihrer schnellen Differenzierung ist besonders notwendig (MOSSEL 1986).
Für die hygienische Beurteilung und Haltbarkeit von Milch ist nicht nur die Gesamtkeimzahl zu betrachten, es müssen darüber hinaus die spezifischen Eigenschaften von Keimgruppen (Proteolyten, Lipolyten) berücksichtigt werden (TAKACS 1969, MOTTAR 1981, SUHREN et al. 1980, CHRISTEN u. SENICA 1987, BRAUN u. FEHLHABER 2001). Mit zunehmendem Keimgehalt in frischer Rohmilch nimmt der Anteil der grampositiven Mikrokokken und Staphylokokken ab, während der Anteil der aus der Melkanlage und der Umwelt stammenden gramnegativen Keime zunimmt (KURZWEIL u. BUSSE 1973, TOLLE u. WHITTLESTONE 1976, JAYARAO u. WANG 1999, GODFAY u. MOLLA 2000).
2.2.1.1 Pseudomonaden
Die Pseudomonaden gelten als Saprophyten, die natürlicherweise in den Lebensräumen von Kühen vorkommen (KIRK u. BARTLETT 1984, JASPE et al.
1995, KASALICA u. OTENHAJMER 1995). Sie gelten als Indikatoren für schlechte hygienische Verhältnisse bei der Gewinnung und Behandlung von Milch. In gekühlter Rohmilch sind Pseudomonaden die dominierende Gruppe von aeroben, gram-
negativen, psychrophilen Keimen (KIELWEIN 1968; THOMAS u. THOMAS 1973;
TOLLE u. SUHREN 1983, DESMASURES 1997, JAYARO u. WANG 1999). Das Wasser stellt für diese sogenannten Nasskeime die wichtigste Kontaminationsquelle dar (BECK 1972, WÄLLHÄUSER 1978, NICHOLLS et al. 1981, COUSIN 1982, HICKS et al. 1991).
Pseudomonas aeruginosa wird als pathogener Keim eingestuft. Euterduschen und kontaminierte Melkanlagen können Infektionsquellen für Mastitiden beim Rind mit Pseudomonas aeruginosa darstellen (WEIGT u. FRERKING 1967, McDONALD et al. 1977, KIRK u. BARTLETT 1984, ERSKINE et al. 2002). Für den Nachweis von Pseudomonaden eignet sich der Glutamat-Stärke-Phenolrotagar (GSP) nach KIELWEIN (1969) (Bebrütungstemperatur 25 °C, 72h) .
2.2.1.2 Enterobacteriaceae
Einige Vertreter der Familie der Enterobactericeae werden als „koliforme“ Keime zusammengefasst, sofern sie die Laktose unter Säure- und Gasbildung abbauen.
Neben dem Darm von Mensch und Tier sind der Boden und das Wasser natürliche Biotope für diese Gram-negativen, stäbchenförmigen Mikroorganismen. Da sie in ungenügend gereinigten und ungenügend desinfizierten milchwirtschaftlichen Geräten in großer Zahl festzustellen sind, lässt die Größenordnung ihres Vorkommens in Rohmilch Rückschlüsse auf die Hygiene bei der Milchgewinnung und –behandlung zu (KIELWEIN 1976, SCHMIDT-LORENZ u. SPILLMANN 1988, GODFAY u. MOLLA 2000). Zur selektiven Anreicherung wird der Violet-Red-Bile Agar vorgeschrieben (LMBG §35), der bei 30 °C für 24 Stunden inkubiert wird. Die Hemmung der unerwünschten, grampositiven Begleitflora erfolgt durch Kristallviolett, während Gallesalze das Wachstum der Enterobactericaeen begünstigen. Durch die Milchsäurebildung und Neutralrot als Indikator färben sich die Bakterienkolonien rot.
2.2.1.3 Hefen
Hefen sind in der Natur weit verbreitet. Die meisten Arten sind aber für die Milchwirtschaft ohne Bedeutung (KIELWEIN 1994). Einige Hefen spiegeln den Zustand der Lebens- und Umweltbedingungen wieder, in denen sie angetroffen
werden. Im allgemeinen werden hohe Kontaminationsraten von Hefen auf Oberflächen und in der Luft mit einem schlechten Hygienemanagement in Verbindung gebracht (VILJOEN u. GREYLING 1995, WELTHAGEN u. VILJOEN 1998). Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass bestimmte Hefearten gegenüber üblichen Reinigungs- und Desinfektionsmitteln resistent sind, und somit nur eine geringe Reduktion auf den Arbeitsoberflächen erreicht werden kann (FLEET 1990, LAUBSCHER u. VILJOEN 1999). Die Vermehrung von Hefen in bestimmten Lebensmitteln hängt entscheidend von den gegebenen ökologischen Faktoren ab (MOSSEL und INGRAM 1955, FLEET 1990, DEAK 1991). Üblicherweise wird eine geringe Menge an Hefen in gekühlter Rohmilch angetroffen, weil sie in direkter Konkurrenz zu den schneller wachsenden, psychrotrophen Bakterien stehen. Die Anwesenheit psychrotropher Erreger ist ein hemmender Faktor für das Wachstum von Hefen in 4 °C-gekühlter Rohmilch. Erst oberhalb einer Temperatur von 25 °C wird das Wachstum bestimmter Hefearten in der Sammeltankmilch evident (ROOSITA u. FLEET 1996, VILJOEN 1996).
2.3 Methoden zur mikrobiologischen Untersuchung von Oberflächen
2.3.1 Destruktive und nicht-destruktive Methoden
Das Deutsche Institut für Normung (DIN) hat Entwürfe für eine standardisierte Bestimmung des Oberflächenkeimgehaltes auf Einrichtungs- und Bedarfsgegenständen im Lebensmittelbereich herausgegeben (Manuskript DIN 10113-1, -2 und –3). Die Untersuchungsmethode, das Probenmaterial, die Beschaffenheit der zu beprobenden Oberflächen und die Praktikabilität der Probenentnahme vor Ort beeinflussen die mikrobiologische Aussage (REUTER et al. 1979, THRAN 1979, FLISS et al. 1991, REUTER 1994).
CORRETI (1966) unterscheidet fünf Arten von Probenabnahmemethoden für die bakteriologische Untersuchung von Oberflächen, die REUTER (1984) in nicht- destruktive und destruktive Verfahren weiter unterteilt (Tabelle 5).
Tab. 5: Übersicht von nicht-destruktiven und destruktiven Methoden
Destruktive Verfahren sind für die Untersuchung von Oberflächen in Melkanlagen nicht geeignet (PATTERSON 1971).
Vorteile bieten dagegen nicht-destruktive Methoden, weil sie Probenentnahmen erlauben, ohne dass Oberflächen beschädigt oder verändert werden müssen. Daher findet diese Art von Entnahmeverfahren bei Hygienekontrollen von Arbeitsgeräten und Einrichtungsgegenständen in der Lebensmittelproduktion ihre praktische Anwendung (SNIJDERS et al. 1985). Dem Vorteil einer zügigen Probenentnahme steht die Einbuße an Genauigkeit gegenüber, wobei sowohl die Intensität der bakteriellen Haftung als auch das individuelle Vorgehen des Untersuchers zu wechselnden und unvollständigen mikrobiologischen Ergebnissen führen, und haben daher lediglich einen orientierenden Charakter für eine hygienische Bewertung von Oberflächen (GREATS u. SNIJDERS 1977/78, THRAN 1979, DEZUTTER et al.
1982, BÜLTE u. REUTER 1983, REUTER 1984, SNIJDERS et al. 1985, FLISS et al.
1991).
.
2.3.1.1 Abstrich- oder Abwischverfahren mit Tupfern
Das Abstrich- oder Abwischverfahren mit Tupfern ist eine der ältesten Methoden zur Bestimmung des bakteriologischen Status von Oberflächen. Die zu untersuchenden Flächen werden dabei mit einem oder mehreren Tupfern abgewischt. Anschließend werden die Keime entweder in Flüssigkeiten ausgespült (ausgewalkt) oder durch Direktausstrich des Tupfers auf Nährmedien übertragen. Diese Probenentnahme zeichnet sich durch leichte Handhabung und gute Anwendbarkeit für schlecht
nicht-destruktive Methoden destruktive Methoden Abstrich- oder Abwischverfahren
(Tupferabstrichverfahren) Abdruck- oder Abklatschmethoden Abspül- oder Abschwemmverfahren Direktverfahren oder Direkt-Aufgussverfahren
Abkratz- oder Abschabverfahren
zugängliche Stellen, sowie in dem geringen apparativen und zeitlichen Aufwand aus (ACKERMANN et al. 1982, LAMMERS et al. 1983).
Der hohe Arbeitsaufwand für die Vorbereitung und Aufarbeitung der Tupfer, die schlechte Wiederholbarkeit und der Mangel einer Standardisierung des Verfahrens sind dagegen als Nachteil anzusehen (GREATS und SNIJDERS 1977, 1978, THRAN 1979, SIBOMANA 1980, DEZUTTER et al. 1982, LAMMERS et al. 1983, SNIJDERS et al. 1985, MÜLLER u. HILDEBRANDT 1989, HILDEBRANDT u. WEISS 1992). Es wurde versucht, die Tupferprobenentnahme zu standardisieren, indem die abzutupfende Fläche mit Schablonen festgelegt und einheitliches Tupfermaterial verwendet wurde (ANGELOTTI et al. 1958, CORRETI 1966, ELLNER u. ELLNER 1966, BARLETT u. HUGHES 1969, EMSWEILER et al. 1978, DEZUTTER et al.
1982, SIBOMANA 1980, HAPPE 1993, LOUWERS u. KLEIN 1994a). Große Schwierigkeiten bei der Probenentnahme besteht in der Normierung des Anstelldruckes der Tupfer auf Oberflächen (REUTER 1962, BALLDOCK 1974, BARRY et al. 1978). Ein sogenannter „Trigger“ wurde entwickelt, um den Anpressdruck vorzugeben, der sich aber in der Praxis nicht durchsetzten konnte (REUTER 1963).
Ein nicht zu vernachlässigender Aspekt für Tupferproben ist der Feuchtigkeitsgehalt der Tupfer selbst (REUTER 1963, BAUMGART 1977, BARRY et al. 1972). Ein Vergleich zwischen trockenen und angefeuchteten Tupfern ergab eine höhere Keimausbeute für die feuchten Tupfer auf trockenen Oberflächen (BARNES 1952, KELCH u. FRIES 1959; BAUMGART 1977). Demgegenüber konnte auf angefeuchteten Flächen kein Unterschied in der Keimausbeute zwischen feuchten und trockenen Tupfern feststellt werden (YILDRIM 1971).
Untersuchungen von Tupfern mit und ohne Transportmedium kommen zu dem Ergebnis, dass Tupfer ohne Transportmedium innerhalb von max. 12 Stunden bei 5 °C Transporttemperatur ausgewertet werden müssen, um ein repräsentatives Ergebnis zu erhalten. Für Tupfer mit Transportmedium werden max. 48 Stunden bei einer Lagerungstemperatur von max. 10 °C angegeben (KLEINER 2000). Andere Untersuchungen kamen zu dem Ergebnis, dass Tupfer mit Transportmedium eine maximale Lagerungszeit von 24 Stunden bei 4 °C haben (MURMANN u. V.D.
HEYDE 1994). Ein Vorteil von feuchten Tupfern ist, dass die Überlebenszeit der Bakterien im Tupfer erheblich verlängert wird (ELLNER u. ELLNER 1966). Tabelle 6 enthält eine Übersicht, welche Anwendungsmöglichkeiten für Tupferverfahren bestehen und welche Oberflächen damit untersucht wurden.
Die Ergebnisse sind nicht uneingeschränkt vergleichbar. Große Unterschiede zeigen die Versuchsansätze bezüglich der zu untersuchenden Oberflächen und in der Angabe von Referenzmethoden. Aufgrund hoher Schwankungen in der Wiederfindungsrate der Keimzahlen besitzen Tupferproben lediglich einen orientierenden Charakter zur Beurteilung des hygienischen Status von Flächen (CORTTI 1966, STOLLE 1985).
Tab. 6: Prozentuale Wiederfindung der Keime nach Anwendung verschiedener Tupferverfahren nach Literaturangaben
1 TT: ein trockener Tupfer 1 NT: ein feuchter Tupfer
NTT: Nass-Trockentupfer-Methode Xa: arithmetischer Mittelwert Xg: geometrischer Mittelwert
* glatte und rauhe Oberflächen an einem Schweineschlachtband
Wiederfindung % Autor Tupfer-
Technik Oberfläche
min.
% Xa % max. %
Porzellan 30,4 49,5 69,9 ANGELOTTI et al.
(1958) 1 TT
Porzellan 24,8 42,5 60,3 Beton
Gummi ACKERMANN et al.
(1982) 1 NT
Kunstharz
38 k. A. 112 Alufolie 67,8 94,9 99,8 CORETTI (1966) 1 NT
Holz 12,9 36,7 48,1
DEZUTTER et al. (1982) NTT Tierkörper 33,8 – 57,5 EMSWEILER et al.
(1978) 1 NT Fleisch
k. A.
47
K. A.
HAPPE (1993) NTT Stahl 31,3 50,2 94,6
INGRAM u. ROBERTS
(1976) NTT Fleisch k. A. 10 – 44,0 k. A.
Beton LAMMERS et al. (1983) 1 NT
Fliese 55 k. A. 99
LOUWERS u. KLEIN
(1994) NTT Oberfläche* 70 k. A. 90
REUTER (1984) 1 NT Tierkörper k. A. 34 k. A.
Kacheln k. A. 65 k. A.
Kunststoff k. A. 52 k. A.
RÜHLMANN u.
FELDHUSEN (1995) NTT
Stahl k. A. 69 k. A.
SIBOMANA (1980) 1 TT Tierkörper 0,9 27,8 Xg 83,7 SNIJDERS et al. (1984) NTT Tierkörper 48,9 k. A. 88,2
STOLLE (1985) NTT Tierkörper < 1 32 81
2.3.1.2 Abdruck- oder Abklatschmethoden
Abdruck- oder Abklatschmethoden sind in der DIN 10113 (1997) als semiquantitative Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen mit nährbodenbeschichteten Entnahmevorrichtungen beschrieben.
Für Schlachtkörper ist ein indirektes Abdruckverfahren, bei dem mit einer sterilen Stahlplatte ein Abdruck erfolgt und die anhaftenden Keime anschließend auf einen Nährboden übertragen werden, entwickelt worden (LEISTNER 1956).
Für das direkte Abdruckverfahren wird eine Agaroberfläche gegen die zu untersuchende Oberfläche gedrückt. Heute werden für die Untersuchungen von Lebensmitteloberflächen u. a. RODAC- (Replicate Organism Direct Agar Contact-) Platten benutzt. Ein Vorteil dieses zeit- und kostensparenden Verfahrens besteht darin, dass die Entnahmeausrüstung gleichzeitig das Wachstumsmedium darstellt und somit Aufarbeitungsschritte der Proben entfallen (BAUMGART 1977, SNIJDERS u. GREATS 1977, 1978, LAMMERS et al. 1983). Allerdings sind der RODAC- Methode verfahrensbedingt Grenzen gesetzt.
Auf glatten Oberflächen kann diese Technik wohl geeignet erscheinen, wohingegen auf gewölbten Flächen häufig der innige Kontakt zu den mehr oder weniger starren Nährbodenträgern fehlt. Für raue, kleine und unzugängliche Probenentnahmestellen ist das Aufbringen des Kontaktnährbodens schwierig, wenn nicht sogar unmöglich.
Sind feuchte und nasse Flächen zu beproben, verteilen sich die Mikroorganismen im Feuchtigkeitsfilm auf dem Nährboden, oder sie werden mit der Flüssigkeitssuspension nur unzureichend vom Nährbodenträger aufgenommen (NISKANEN u. PROJAH 1977, BÜLTE u. REUTER 1982, LAMMERS et al. 1983, HESSE 1992, MUSAH 1993).
Für gebogene und unebene Flächen ist eine Weiterentwicklung der RODAC - Platten seit kurzem kommerziell erhältlich. Es sind sogenannte contact slides (HYCON), auf denen, je nach Arbeitseinsatz, unterschiedliche flexible Kulturmedien aufgebracht sind. Durch die Flexibilität der contact slides ist eine größere Anzahl an unterschiedlichen Oberflächenstrukturen beprobbar als mit den üblichen RODAC- Kontaktnährmedien (POWITZ u. BALSAMO 2002).
2.3.1.3 Abspül- oder Abschwemmverfahren
Das Abspül- oder Abschwemmverfahren stellt eine weitere Form der nicht- destruktiven Probenentnahmeverfahren dar. Dabei werden die auf einer Oberfläche anwesenden Mikroorganismen mit einer Spülflüssigkeit abgespült, aufgefangen und weiter aufbereitet. Diese Methode wird vorwiegend zur Ermittlung des Oberflächenkeimgehaltes auf Schlachttierkörpern, aber auch zur Bestimmung des Keimgehaltes von Suspensionsträgern im Zuge von Desinfektionsmittelprüfungen eingesetzt (HANEKE 1991).
Zur Überprüfung des Reinigungserfolges von Melkanlagen wird diejenige Milch aufgefangen, die als erstes vom Milchabscheider in den Sammeltank abgepumpt wird, um deren Gesamtkeimzahl und das Auftreten koliformer Keime zu bestimmen (MROZEK 1969). Im Rahmen der dänischen Erzeugerberatung werden ausgesuchte Bereiche in Melkanlagen und Kühleinrichtungen mit Trinkwasser eines bekannten Keimgehaltes gespült. Anschließend wird der Differenzkeimgehalt zum Trinkwasser, z. B. bezogen auf die Oberfläche der Melkanlage, ermittelt (HOLZUM 1983). Für diese Untersuchung kann auch sterile Magermilch als Spülmittel verwendet werden, da diese wegen einer geringeren Oberflächenspannung zu einer weitergehenden Oberflächenbenetzung der Bauteile führt und somit auch subletale Keime besser erfasst (KIELWEIN 1981). Für den gleichen Zweck benutzt WINTERER (1975) eine 45 °C warme, homogenisierte und sterile Vollmilch als Spülflüssigkeit. Diese Verfahren haben erhebliche Vorteile, weil sie zu aussagekräftigeren Befunden führen (BAUMGART 1977, THRAN 1979).
2.3.2 Nass-Trockentupfer Verfahren (NTT)
Um Ergebnisse vergleichen zu können, sollten die mikrobiologischen Analysemethoden standardisiert werden (NOTERMANS 1991, RIPKE 1991, REUTER 1994).
Der Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte des Deutschen Institutes für Normung e.V. hat im Arbeitsausschuss „Veterinärmedizinische Fleischuntersuchung“ in Abstimmung mit dem Arbeitsausschuss „Mikrobiologische Milchuntersuchung“ die DIN 10113-1 (1997) erarbeitet. Dort wird das Nass-
Trockentupfer Verfahren als quantitatives Tupferverfahren für die Bestimmung des Oberflächenkeimgehaltes auf Einrichtungs- und Bedarfsgegenständen beschrieben.
Hierbei wird die zu untersuchende Oberfläche in einer bestimmten Größen markiert (z. B. mit einer Schablone) und anschließend zuerst mit einem angefeuchteten und dann mit einem trockenen Watteträger abgestrichen.
LOUWERS u. KLEIN (1994b) ziehen in ihren Untersuchungen das NTT Verfahren als Referenzmethode heran, weil es zu präzisen Ergebnissen führt. Sie lehnen diese Methode als Routineverfahren jedoch wegen des großen Aufwandes (zwei Tupfer) ab. KNAUER-KRAETZL u. REUTER (1994) sehen in Problembereichen (Kunststofffugen) das Nass-Trockentupfer Verfahren als gut einsetzbar an.
SCHULZE u. HILDEBRANDT (1994) kommen in einer vergleichenden Beurteilung der Methoden NTT und RODAC zu folgender Schlussfolgerung: Das NTT Verfahren erfordert bei der Probenentnahme und Tupferaufarbeitung wesentlich mehr Arbeits- und Zeitaufwand. Des Weiteren liegt die mikrobiologische Nachweisgrenze beim NTT Verfahren bei 40 KbE/cm². Diese Methode kann aber durch Modifikationen (z.B.
Tupferkopfgröße) empfindlicher gestaltet we rden. Das NTT Verfahren bietet bei starker Kontamination von Oberflächen Vorteile, wenn differenzierte Ergebnisse erforderlich sind. Die mikrobiologische Wiederfindungsrate liegt zwischen 70 – 90 % bzw. bei 80 % (LOUWERS u. KLEIN 1994b, RÜHLMANN u. FELDHUSEN 1995).
RÜHLMANN u. FELDHUSEN (1995) heben in ihren Untersuchungen die Überlegenheit der mikrobiologischen Wiederfindungsrate mit dem NTT Verfahren gegenüber der Probenentnahme mittels zweier Kontaktnährböden hervor, deren Wiederfindungsraten um 10 – 20 % bzw. 19 – 30 % geringer ausfällt als die des NTT Verfahrens. Jedoch sie sind auch der Meinung, dass aufgrund des Arbeitsaufwandes das NTT Verfahren nicht als Routineverfahren geeignet ist.
2.3.2.1 Tupferproben aus Melkanlagen zur Überprüfung des hygienischen Status
In der Praxis werden von Tierärzten, Milcherzeugerberatern und Landwirten häufig Tupferproben aus Melkanlagen mit folgender Zielvorstellung entnommen (KRAMER 2002):
1. Auffindung von Anreicherungsstellen für Keime in der Melkanlage, die ursächlich für eine erhöhte Keimzahl in der Sammeltankmilch verantwortlich sind.
2. Auffindung von Ursachen, die zu einem plötzlichen und unerklärlichen Anstieg der z. B. durch Hefen verursachten sub - bzw. klinischen Mastitisfälle im Milcherzeugerbetrieb führen.
Verschiedene Anwender versuchen den Reinigungs- und Desinfektionserfolg von Reinigungsautomaten oder von Zwischendesinfektionsmaßnahmen mit Hilfe von Tupferproben zu überprüfen (PELZER et. al 1997; MODEL 1997). In der Abteilung Zytobakteriologie der LUFA Nord/West der Landwirtschaftskammer Hannover werden regelmäßig Tupferproben aus Melkanlagen untersucht, die zur Oberflächenkeimbestimmung von Zitzenformschläuchen, aus Sammelstücken und aus kurzen und langen Milchschläuchen stammen (REITER 2002).
Tab. 7: Anzahl untersuchter Tupferproben aus Melkanlagen (LUFA Nord/West 1999 – 2001)
Jahr Anzahl der untersuchten Tupfer
2001 278
2000 527
1999 282
2.3.3 Mikrobiologische Untersuchung der Proben
2.3.3.1 Prinzip der Keimzahlbestimmung mittels Tupferproben
Für eine quantitative Keimzahlbestimmung ist die Homogenität der Mischung einer Probenlösung oder Probensuspension notwendige Voraussetzung. Die Homogenität der Proben wird durch das Ausschütteln der Tupferproben erreicht (EMSWEILER et al. 1977, 1978, DEZUTTER et al. 1982, ELLERBROEK et al. 1992). Danach werden diese homogenen Proben über dezimale Verdünnungsreihen eingestellt und dann
auf feste Nährmedien überführt. Für die Homogenisierung wird eine mindestens 10
%ige Verdünnung der Probe im Verdünnungsmedium empfohlen, um auf diese Weise eine Vereinzelung von Keimen zu erreichen. Als Verdünnungsflüssigkeit dient im Allgemeinen eine viertelnormale Ringerlactat-Lösung oder eine 0,85%ige Kochsalzlösung mit 1%iger Pepton-Lösung (REUTER 1970). Zur Herstellung einer dezimalen Verdünnungsreihe wird 1 ml der Ausgangsverdünnung bzw. der folgenden Verdünnungsstufen in je 9 ml Verdünnungsflüssigkeit (zum Ansatz der nächsthöheren Verdünnung) gegeben.
2.3.3.2 Prinzip der Keimzahlbestimmung in flüssigen Substraten
Molkereien, Milchsammelstellen und Rahmstationen haben zur Bewertung der Güte- und Klasseneinteilung die bakteriologische Beschaffenheit jeder Anlieferungsmilch untersuchen zu lassen oder selbst zu untersuchen. Die Verfahrensvorschriften sind in der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetztes (LMBG), Gliederungsnummer L 01.00-5, und als DIN-Standard (DIN 10161 1984) festgelegt. Es kann dabei für den Nachweis aerober Keime zwischen dem Oberflächenverfahren (Spatelverfahren) und dem Gussplattenverfahren ausgewählt werden. REUTER (1970) ermittelte für das Oberflächenverfahren eine größere Ausbeute im Vergleich zur Gussplatte, insbesondere bei obligat aerob wachsenden Keimen.
Ein weiterer Vorteil des Oberflächenverfahrens besteht darin, dass die Keime anhand ihrer Morphologieeigenschaften grob identifiziert werden können. WEIß et al.
(1989) finden in ihren Untersuchungen zum Keimgehalt in Rohmilch bei Anwendung der Oberflächentechnik durchschnittlich höhere Koloniezahlen als beim Gussplattenverfahren.
Der Vorteil des Gussplattenverfahren liegt in der im Vergleich zum Oberflächenverfahren größeren Menge des erfassbaren Inokulums (1 ml zu 0,1 ml).
Dabei senkt sich die Nachweisgrenze bei der Gussplattentechnik um eine Zehnerpotenz. Des Weiteren erweist sich das Gussplattenverfahren als präzisere Methode (BÖTTCHER u. HILDEBRANDT 1991). Es konnte mit dem Gussplattenverfahren aus wiederholten Ansätzen ein Präzisionsmangel von 21,8 %
errechnet we rden. Dieser Präzisionsmangel wird durch biologische und technische Fehlerquellen hervorgerufen. Biologische Fehlerquellen liegen im spezifischen Wachstum der einzelnen Keimarten, z. B. unkontrollierbare Aggregationen oder mangelhafte Annahme der Inkubationsbedingungen. Zu technischen Fehlerquellen zählen Mängel bei der Konservierung, Präparation, Inkubation und Auszählung der Platten (HEESCHEN et al. 1977).
3. EIGENE UNTERSUCHUNG
3.1 Material
3.1.1 Vorversuch
Für die Erfassung der mikrobiologischen Beschaffenheit von Oberflächen mit dem modifizierten Nass –Trockentupfer Verfahren (DIN 10113:1997- 07) wurden zunächst verschiedene Einflüsse wie Oberflächenmaterialien, Keimsuspensionen, Tupferformen, Spülflüssigkeit und Arbeitstechniken überprüft.
3.1.1.1 Werkstoffe für die Kontamination mit Mikroorganismen
Als Kontaminationsflächen für Mikroorganismen wurden Materialien ausgewählt, die als milchführende Oberflächen in Melkanlagen verwendet werden. Dafür wurden neue und alte Zitzenformschläuche aus Neopren (Neo) und Silikon (Sil) benutzt, aus denen 7 cm² große Stücke ausgestanzt wurden. Die Stücke weisen eine konkave und eine konvexe Seite auf. Des Weiteren sind 8 cm2 große polierte Stahl- und Glassplättchen in planer Form verwendet worden. Sämtliche Materialien wurden vor ihrem Einsatz gereinigt und autoklaviert.
3.1.1.2 Technische Mittel
• mikrobiologische Sicherheitswerkbank nach DIN 12950, Klasse 2 (Fa. Integra Biosciences Model 2F120-II GS)
• Laborrüttler (Typ Relax 1; 2.400 U/min; Fa. Jürgens Heildolph KG)
• Pipettierhilfen der Fa. Eppendorf (50 µl bis 1000 µl )
• elektrische Pipettierhilfe accu jet® (Fa. Band)
• sterile Glaspipetten (1 ml bis 10 ml)
• sterile Einmalpetrischalen (Fa. Greiner Labortechnik GmbH)
• Fa. Memmert Brutschränke (25 °C; 30 °C; 37 °C)
• Einmalhandschuhe
• Handdesinfektionsmittel
• sterile Erlenmeyerkolben 150 ml
• sterile Kunststoff-Einmalgefäße 15 und 50 ml (Fa. Sarstedt)
• Reaktionsgefäße der Fa. Eppendorf (100 µl)
• Gefrierschrank ( –80 °C)
• Zentrifuge Omnifuge 2 ORS (Fa. Heraeus)
3.1.1.3 Mittel zur Probenentnahme
3.1.1.3.1 Tupfer
Es wurden Wattetupfer der Fa. Greiner eingesetzt (16,0/155 mm), die von der Bezirksregierung Hannover (Katalog „Amtliche Überwachung betrieblicher Eigenkontrollen“ angelehnt an DIN-Entwurf 10113: 1997–07) empfohlen werden.
3.1.1.3.2 Spülproben
Als Spülflüssigkeit wurde sterile Ringerlösung benutzt.
3.1.1.4 Mittel für mikrobiologische Ansätze 3.1.1.4.1 Verdünnungs- und Nährlösungen
• UHT Milch
• Nutrition-Bouillon (Oxoid)
• 1:20 Glycerin- und TSB- (Trypticase Soy Broth) Pufferlösung
• sterile Ringerlösung
3.1.1.4.2 Keimarten
• Escherichia coli (ATCC 11229)
• Staphylococcus aureus (ATCC 6538 )
• Streptococcus agalactiae (aus der Stammsammlung der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch)
• Pseudomonas aeruginosa (aus der Stammsammlung der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch)
3.1.1.4.3 Mikrobiologische Nährböden
Die Nährböden wurden nach den Vorgaben des LMBG § 35 und der VDLUFA vom Labor der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch selber hergestellt (siehe Anhang Tabelle 2).
• Plate Count Agar (Caseinpepton-Glucose-Hefeextrakt-Agar)
• VRB Agar (Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Agar)
• GSP Agar (Pseudomonas-Aeromonas-Selektivagar nach Kielwein)
• HGC Agar (Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agar)
3.1.2 Feldversuch
3.1.2.1 Milcherzeugerbetriebe
Es wurden Melkanlagen in 33 Milcherzeugerbetrieben in Niedersachsen anhand des Auszahlungsberichtes nach der Milch – Güte – Verordnung ausgewählt.
3.1.2.2 Technische Mittel
• Betriebsfragebogen (siehe Anhang Tabelle 3)
• Einmalhandschuhe
• elektrische Pipettierhilfe accu jet® (Fa. Band)
• sterile Glaspipetten (1 ml bis 10 ml)
• sterile Glasgefäße 200 ml
• Leitfähigkeitsmessgerät „Mastitron plus V“ (Fa. Milku)
• Thermometer
• Kühlbox mit Kühlakkus
• 70 %ige Ethanollösung
• Zellstofftücher
• Nonius