Charakterisierung von Tumorstammzellen eines Plattenepithelkarzinoms des Hypopharynx

(Prof. Dr. med. D. Beutner)

der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen

Charakterisierung von Tumorstammzellen eines Plattenepithelkarzinoms

des Hypopharynx

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen

vorgelegt von

Ronja Kristine Hähne, geb. Gratz

aus Hannover

Göttingen 2020

Referent: Prof. Dr. med. F. Ihler

Koreferent/in: Priv.-Doz. Dr. med. dent. Dr. med. P. Brockmeyer Drittreferent/in: Prof. Dr. med. M. Oppermann

Datum der mündlichen Prüfung: 20. April 2021

zellen eines Plattenepithelkarzinoms des Hypopharynx“ eigenständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.

Oldenburg, den ………..………… ……….………

(Unterschrift)

Die Daten, auf denen die vorliegende Arbeit basiert, wurden teilweise publiziert:

Ihler F, Gratz R, Wolff HA, Weiss BG, Bertlich M, Kitz J, Salinas G, Rave-Fränk M, Canis M (2018): Epithelial-Mesenchymal Transition during Metastasis of HPV-Negative Pharyngeal Squamous Cell Carcinoma. Biomed Res Int 2018, 7929104

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN...III VERZEICHNIS DER TABELLEN...III VERZEICHNIS DES ANHANGS...III VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN...IV

1 EINLEITUNG...1

1.1 PLATTENEPITHELKARZINOMEDES KOPF-HALS-BEREICHES...1

1.2 TUMORBIOLOGIE...3

1.2.1 Tumorbiologie und Metastasierung...3

1.2.2 Epithelial-mesenchymale Transition...4

1.2.3 Tumorheterogenität und Tumorstammzellen...5

1.2.4 E-Cadherin als epithelialer Marker...7

1.2.5 CD44 als Tumorstammzellmarker...7

1.3 FRAGESTELLUNG...9

2 MATERIAL UND METHODEN...10

2.1 ETHIK...10

2.2 GEWINNUNGUND KONSERVIERUNGVONNATIVEN GEWEBEPROBEN...11

2.2.1 Konservierung für die Genexpressionsanalyse...11

2.2.2 Konservierung für Immunhistochemie...11

2.3 XENOGRAFT-MODELL...12

2.3.1 Tierpflege...12

2.3.2 Implantation des Tumors...12

2.3.3 Verlaufskontrolle...12

2.3.4 Gewinnung von Xenotransplantaten...13

2.3.5 Dissoziation in Einzelzellen...13

2.4 ZELLKULTUR...15

2.4.1 Etablierung einer Zellkultur...15

2.4.2 Herstellen von Einzelzellsuspension...15

2.4.3 Zählen der Zellen...16

2.4.4 Trypanblaufärbung...16

2.4.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen...16

2.4.6 Sphäroidkultur...17

2.5 IMMUNHISTOCHEMIE...19

2.5.1 Kern-Plasma-Färbung von Zellen...19

2.5.2 Vorbereitung der Gewebeproben für die Immunhistochemie...19

2.5.3 Kern-Plasma-Färbung der Gewebeproben...20

2.5.4 Färbungen der Gewebeproben mit E-Cadherin und CD44...20

2.6 DURCHFLUSSZYTOMETRIE...22

2.7 GENEXPRESSIONSANALYSE...23

2.7.1 Herstellung der Proben aus Zellkulturen...23

2.7.2 Verarbeitung von Proben im Transkriptomanalyselabor...23

2.7.3 Datenanalyse durch das Transkriptomanalyselabor...23

2.7.4 Auswertung Mithilfe ausgewählter Gensets...24

3 ERGEBNISSE...26

3.1 PATIENTENCHARAKTERISTIKA...26

3.1.1 Patient H194...26

3.1.2 Patient H196...27

3.1.5 Patient H208...29

3.2 X^ENOGRAFT-M^ODELL...30

3.3 ZELLKULTUR...33

3.4 EXPRESSIONVON E-CADHERIN...35

3.4.1 Immunhistochemie...35

3.4.2 Durchflusszytometrie...35

3.4.3 Genexpressionsanalyse...36

3.5 E^XPRESSIONVON CD44...38

3.5.1 Immunhistochemie...38

3.5.2 Durchflusszytometrie...38

3.5.3 Genexpressionsanalyse...38

3.6 GENEXPRESSIONSANALYSE...41

3.6.1 Allgemeine Betrachtung...41

3.6.2 Vergleich der Genexpression durch ausgewählte Gensets...43

4 DISKUSSION...46

4.1 METHODEN...46

4.2 VERGLEICHDES PRIMÄRTUMORSMITSEINER METASTASE...47

4.3 TUMORSTAMMZELLEIGENSCHAFTENUNDMESENCHYMALER PHÄNOTYPINDER SPHÄROIDKULTUR...49

4.4 DER VERLUSTVON E-CADHERINALS MARKERFÜR EMT...51

4.5 CD44 ALS TUMORSTAMMZELLMARKER...54

5 ZUSAMMENFASSUNG...58

6 ANHANG...60

7 LITERATURVERZEICHNIS...71

DANKSAGUNG...83

Abb. 1: Biometrie der Gewebeproben...32

Abb. 2: Zellkulturen im Verlauf...34

Abb. 3: Expression von E-Cadherin...37

Abb. 4: Expression von CD44...40

Abb. 5: Varianz in der Genexpression der Gewebeproben und der Zellkulturen...42

Abb. 6: Kombinationen der Probenvergleiche...43

Abb. 7: Überschneidungen der verwendeten Gensets...44

Verzeichnis der Tabellen

Tab. 2: Gewebeproben der II. Generation...31

Tab. 3: E-Cadherin-positive Zellen in der Durchflusszytometrie...35

Tab. 4: Genexpression von E-Cadherin (CDH1)...36

Tab. 5: CD44-positive Zellen in der Durchflusszytometrie...38

Tab. 6: Genexpression von CD44...39

Tab. 7: Expressionsanalyse der Gewebeproben und Zellkulturen mittels Gensets...45

Verzeichnis des Anhangs

Anhang II: Liste des Zubehörs...62

Anhang III: Liste der Antikörper...63

Anhang IV: Liste der Versuchs- und Nachweiskits...63

Anhang V: Liste der Geräte...64

Anhang VI: Liste der Tiere...65

Anhang VII: Liste der Software...65

Anhang VIII: Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Medien...65

Anhang IX: Immunhistochemische Schnitte: Übersichtsbilder...66

Anhang X: Auflistung der Gene der verwendeten Gensets...67

cDNA complementary DNA, komplementäre Desoxyribonukleinsäure cRNA complementary RNA, komplementäre Ribonukleinsäure

CUP cancer of unknown primary, Karzinom mit unbekanntem Primärtumor DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGF epidermal growth factor, epidermaler Wachstumsfaktor EMT epithelial-mesenchymale Transition

FDR false discovery rate, Rate der falsch-positiven Ergebnisse FGF fibroblast growth factor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor

FKS fetales Kälberserum

GSEA gene set enrichment analyses, Genanreichungsanalyse

HNO Hals-Nasen-Ohrenheilkunde

IVC individual-ventilated cages, einzeln belüftete Käfige

IVT In-vitro-Transkription

KHK koronare Herzkrankheit

kAECG-Medium komplettiertes Airway-Epithelial-Cell-Growth-Medium

LAVES Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit MET mesenchymal-epitheliale Transition

MSigDB Molecular Signatures Database

nom. nominal

ns nicht signifikant

PBS Phosphate-buffered Saline, phosphatgepufferte Salzlösung PCA principal component analysis, Hauptkomponentenanalyse

PE Phycoerythrin

RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

TAL Transcriptome and Genome Analysis Laboratory, Transkriptom- und Genomanalyselabor

TM Trademark

TNM-Klassifikation T = Tumor = Primärtumor, N = Node = Lymphknoten, M = Metastasis = Fernmetastase

UICC Union for International Cancer Control

upm Umdrehungen pro Minute

ZTE Zentrale Tierexperimentelle Einrichtung

1 Einleitung

1.1 Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches

An bösartigen Tumore des Kopf-Hals-Bereichs erkranken jährlich weltweit 550 000 Men- schen und 380 000 Todesfälle werden hierdurch registriert (Global Burden of Disease Can- cer Collaboration et al. 2017). Bei Männern sind sie die sechsthäufigste Tumorentität welt- weit (Moral und Paramio 2008). Bei Frauen sind sie weitaus seltener, nehmen allerdings korrelierend zu dem vermehrten Auftreten von weiblichen Raucherinnen zu (Strutz und Mann 2001). Kopf-Hals-Tumore unterscheiden sich in der Lokalisation, Histologie, Epide- miologie und Ätiologie. Die häufigste Lokalisation für bösartige Tumore im Kopf-Hals- Bereich ist die Mundhöhle (Simon und Plinkert 2008). Weiterhin treten maligne Ge- schwulste im Larynx und im Pharynx auf. Letzterer lässt sich in Naso-, Oro- und Hypopha- rynx unterteilen, wobei bösartige Tumore des Hypopharynx die schlechteste Prognose aller Kopf-Hals-Malignitäten haben (Shen et al. 2013). Histologisch finden sich bei über 90 % der Kopf-Hals-Tumore ein Plattenepithelkarzinom, aber auch Adenokarzinome, Sarkome, lymphoepitheliale Tumore und Melanome (Riede et al. 2004; Kumar et al. 2009).

Plattenepithelien entwickeln sich aus embryonalem Bindegewebe, dem unpolaren Me- senchym. Es besteht wie alle Epithelien aus Zellen mit apikaler-basaler Zellpolarität, die durch Zell-Zell-Kontakte wie Zonula adhaerens, Zonula occludens und Desmosomen auf- rechterhalten wird (Welsch und Deller 2014). Im Hypopharynx findet sich unverhorntes mehrschichtiges Plattenepithel. Dabei befinden sich die mitotisch aktiven Stammzellen in der Basalschicht auf der Basalmembran, welche eine mechanische Grenze zum darunter liegenden Gewebe bildet (Lüllmann-Rauch 2015). Von der Basalschicht aus steigen die Zellen über die Intermediärschicht zur Superfizialschicht am Lumen auf und differenzieren sich dabei aus (Lüllmann-Rauch 2015). Ist die Ausdifferenzierung gestört, wird dies als Dysplasie bezeichnet, welche je nach Ausprägung in drei Schweregrade eingeteilt werden kann (Pschyrembel 2014). Entarten die Zellen weiter, entsteht ein Carcinoma in situ, ein bösartiger Tumor aus epithelialen Zellen, welcher noch nicht die Basalmembran durch- bricht. Bilden sich weitere Mutationen und Veränderungen aus, entwickelt sich ein Karzi- nom mit invasivem und metastasierendem Verhalten (Lüllmann-Rauch 2015).

Als Risikofaktoren für Plattenepithelkarzinome gelten übermäßiger Alkoholkonsum, Rauchen, Infektionen mit bestimmten Subtypen der humanen Papillomaviren, Ep- stein-Barr-Virus-Infektionen und chronische Exposition mit einigen industriellen Substan- zen (Sankaranarayanan et al. 1998; Strzelczyk et al. 2015). Der Altersgipfel für die Ausbil-

dung von HNO-Tumoren liegt bei Männern zwischen der fünften und siebten, bei Frauen zwischen der sechsten und achten Lebensdekade (Mashberg und Samit 1995).

Als Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von Plattenepithelkarzinomen des Hypo- pharynx gelten vor allem Alkohol- und Nikotinabusus. Sie metastasieren zunächst lympho- gen und später auch hämatogen in Lunge, Leber und Knochen (Buckley und MacLennan 2000; Uwa et al. 2011; Lenarz und Boenninghaus 2012; Kulasinghe et al. 2015). Meist werden Hypopharynxkarzinome erst im fortgeschrittenen Stadium erkannt. Dies liegt am späten Auftreten von Symptomen wie Dysphagie, Odynophagie, Foetor ex ore, Lymphkno- tenschwellungen, Heiserkeit, Hämoptysen, Hämatemesis oder Schmerzen (Grevers et al.

2008; Milisavljevic et al. 2009). Die prätherapeutische Einteilung wird nach klinischer Un- tersuchung sowie Panendoskopie mit Probenentnahme anhand der TNM-Klassifikation (Tumor, Node, Metastasis) und UICC-Stadium (Union for International Cancer Control) festgelegt und ist bedeutend für die Behandlungsmöglichkeiten und die Prognose (Lenarz und Boenninghaus 2012; Wittekind et al. 2015; Wittekind 2017). Günstigenfalls erfolgt die Behandlung durch chirurgische Entfernung des Hypopharynxkarzinoms und gegebenen- falls der regionalen Lymphknoten (Neck dissection). Bei fortgeschrittenen Stadien werden adjuvant oder primär die Tumorregion und ihre Lymphabflusswege bestrahlt oder eine kombinierte platinbasierte Radiochemotherapie durchgeführt. Die Prognose ist bei Hypo- pharynxkarzinomen im Vergleich zu anderen Karzinomen im Kopf-Hals-Bereich sehr schlecht. Bei Tumorprogress versterben die Patienten an den Komplikationen durch lokale Rezidive, Zweittumoren und Fernmetastasen (Scanlon et al. 2013; Baxi et al. 2014).

1.2 Tumorbiologie

1.2.1 Tumorbiologie und Metastasierung

Im Allgemeinen beschreibt der Begriff Tumor ein Geschwulst beziehungsweise eine „ört- lich umschriebene Zunahme des Gewebevolumens“ und kann benigne oder maligne sein (Pschyrembel 2014). Um als bösartig zu gelten, muss er besondere Eigenschaften erlangen.

Hanahan und Weinberg (2011) beschrieben sechs Hauptcharakteristika, die einen bösarti- gen Tumor von gesundem Gewebe unterscheiden. Diese beinhalten Aufrechterhaltung von Signalen zur Proliferation, Entziehung vor Wachstumshemmern, Widerstand gegen den Zelltod und Apoptosis, Induktion von Angiogenese, Möglichkeit zur unendlichen Zelltei- lung sowie Invasivität und Metastasierung (Hanahan und Weinberg 2011). Durch diese sechs Eigenschaften werden die natürlichen Alterungsprozesse einer Zelle und das Gleich- gewicht im Zellverband zerstört.

Invasivität und Metastasierung haben eine besondere Bedeutung für die Prognose und die therapeutischen Anforderungen, da die Metastasierung für über 90 % der tumorassozi- ierten Mortalität verantwortlich ist (Weigelt et al. 2005; Jemal et al. 2006; Steeg 2006;

Patel und Chen 2012). Außerdem kommt es durch tumoröse Absiedlungen zu zusätzlichen Krankheitssymptomen wie beispielsweise pathologischen Knochenbrüchen, Kompression von Organen mit Lumen sowie Tumorthromben oder Tumorembolien (Böcker et al. 2012).

Damit eine Makrometastase entstehen kann, müssen die Zellen eine metastatische Kaskade durchlaufen (Geiger und Peeper 2009). Zunächst findet das Durchbrechen der Basalmem- bran und die Invasion des darunter gelegenen Gewebes statt. Anschließend löst sich eine Zelle oder ein Zellverband los und migriert in der Extrazellulärmatrix zu den Gefäßen. Es erfolgt die Intravasation in Blut- oder Lymphgefäße mit Hilfe geeigneter Oberflächenprote- ine. Hier muss die Zelle außerhalb des Zellverbandes und ohne Kontakte zur Extrazellulär- matrix überleben. Dies würde im gesunden Gewebe in der Anoikis, der eingeleiteten Apop- tose bei Verlust von Zell-Zell-Kontakten, und damit im Zelltod enden (Frisch und Francis 1994). Widersteht die Zelle der Apoptoseeinleitung, zirkuliert die Tumorzelle bis sie im Kapillarbett hängen bleibt oder mit Hilfe von Oberflächenproteinen das Gefäß wieder ver- lässt (Extravasation). Dort erwartet die Zelle ein neues Milieu mit anderem Aufbau, ande- ren Strukturen sowie Signalen als in ihrem Ursprungsgewebe und ihrer Ursprungsumge- bung. Hier gibt es mehrere Möglichkeiten. Erstens kann es aufgrund fehlender wichtiger Signale zum Zelltod kommen. Zweitens kann sich die Zelle in die Quieszenz begeben, einen Status in der G0-Phase des Zellzyklus, in dem sie sich nicht teilt und Jahre überleben

kann (Scholzen und Gerdes 2000; Prince und Ailles 2008). Drittens kann es in einem pas- senden neuen Milieu zur Kolonisation sowie Proliferation und somit zur Ausbildung einer Mikrometastase kommen. Nicht jeder Ort im Körper bietet ein geeignetes Umfeld und so metastasiert jeder Tumor nach einem charakteristischen Muster. Die Kopf-Hals-Karzinome bilden bevorzugt Fernmetastasen in Lunge, Knochen und Leber aus (Kulasinghe et al.

2015). Dieses Phänomen wird in der Seed-and-Soil-Hypothese beschrieben, wonach die Tumorzelle (Seed, Samen) und das Milieu des Metastasierungsortes (Soil, Erdboden) zu- sammenpassen müssen (Paget 1889; Fidler 2003). Damit sich dort die Mikrometastase weiter vergrößern kann, müssen die nutritiven Gegebenheiten verbessert werden (Gimbro- ne et al. 1972) und es kommt zu einer regionalen Gefäßneubildung (Angiogenese). Es bil- det sich eine Metastase mit starker Ähnlichkeit zum Primärtumor aus.

1.2.2 Epithelial-mesenchymale Transition

Anhand der metastatischen Kaskade kann der Vorgang der Metastasierung in zwei Haupt- phasen aufgeteilt werden. Zuerst erfolgt der Weg samt Absiedlung an einem anatomisch entfernten Ort und anschließend das Wachstum nach Vorbild des Primärtumors (Chaffer und Weinberg 2011). Vor allem für die erste Phase braucht die Zelle Eigenschaften wie In- vasivität, Migration und Überleben ohne Adhärenz. Deren Herausbildung lassen sich durch die von Hay (1995) beschriebene epithelial-mesenchymale Transformation erklären. Hier- bei wandelt sich eine durch Zell- und Basalmembrankontakte fest eingebundene und pola- risierte Epithelzelle in eine Zelle mit mesenchymalen Phänotyp um. Da dieser Prozess auch wieder umgekehrt werden kann, wird er auch als epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und mesenchymal-epitheliale Transition (MET) bezeichnet. Ursprünglich verwen- det der Körper EMT bei der Fortpflanzung zur Implantation, Embryogenese und zur Or- ganentwicklung (EMT Typ 1) (Kalluri und Weinberg 2009; Zeisberg und Neilson 2009).

Des Weiteren tritt EMT bei der Wundheilung von chronischen Entzündungen und Fibrosie- rung zur Generierung von aktivierten Fibroblasten auf (EMT Typ 2) (Kalluri und Weinberg 2009; Zeisberg und Neilson 2009). Findet die EMT im Vorgang der Metastasierung statt, so wird sie als EMT Typ 3 bezeichnet (Kalluri und Weinberg 2009; Zeisberg und Neilson 2009). Als Biomarker für die EMT gelten auf der einen Seite der Verlust von epithelialen Markern wie E-Cadherin oder Zytokeratinen sowie der Abbau von Zonula adhaerens und Desmosomen. Auf der anderen Seite erfolgt das Hervorbringen eines mesenchymalen Phä- notyps mit einer spindelförmigen Morphologie sowie mit Expression von N-Cadherin,

α-smooth-muscle-Aktin, einem Vimentin-Zytoskelett und von EMT-vermittelnden Tran- skriptionsfaktoren wie Snail, Slug und Twist (Hay 1995; Gavert und Ben-Ze’ev 2008; Kal- luri und Weinberg 2009). Hervorzuheben ist der Verlust von E-Cadherin (CDH1-Gen) be- ziehungsweise der Wechsel von E-Cadherin zu mesenchymalen Cadherinen wie N-Cadherin (CDH2-Gen), welcher häufig bei Kopf-Hals-Tumoren zu finden ist (Birchmei- er und Behrens 1994; Cavallaro und Christofori 2004; Hanahan und Weinberg 2011).

1.2.3 Tumorheterogenität und Tumorstammzellen

Ursprünglich wurde davon ausgegangen, dass ein Tumor homogen und ausschließlich aus klonalen Zellen aufgebaut sei (Fialkow 1976; Nowell 1976). Allerdings stellte sich heraus, dass sich die Tumorzellen nicht nur durch epigenetische Einflüsse im Phänotyp unterschei- den, sondern sich zudem Subpopulationen mit unterschiedlichen genetischen Veränderun- gen finden lassen (Heppner 1984; Hanahan und Weinberg 2011). Dies wird als Tumorhe- terogenität bezeichnet (Heppner 1984; Hanahan und Weinberg 2011). Zum einen entwi- ckeln sich Subpopulationen durch zusätzliche Mutationen, die durch eine genetische Insta- bilität begünstigt werden (Nowell 1976; Prince et al. 2007). Auf der anderen Seite können sich ganz unterschiedliche Zelllinien hierarchisch aus einer Mutterzelle entwickeln, wie es physiologisch im hämatopoetischen Differenzierungsprozess stattfindet (Till und McCul- loch 1980; Heppner 1984; Eaves 2015). Abgeleitet hiervon beschrieb Reya et al. (2001) die Tumorstammzellhypothese. Diese besagt, dass sich im Tumor eine kleine Population mit typischerweise einem Anteil von weniger als 10 % an Zellen des Gesamtgewebes befindet, welche sich ähnlich wie Stammzellen im gesunden Gewebe verhalten (Reya et al. 2001;

Prince et al. 2007). Prince et al. (2007) konnte diese bei Plattenepithelkarzinomen im Kopf- Hals-Bereich darstellen. Diese Tumorstammzellen teilen sich. Die Tochterzellen sind ent- weder Tumorstammzellen oder differenzieren sich weiter (Clarke et al. 2006). Tumor- stammzellen werden über vier Hauptcharakteristika definiert (Prince und Ailles 2008). Er- stens ist die Selbsterneuerung essenziell. Eine Tumorstammzelle kann einen neuen Tumor entstehen lassen und dessen Heterogenität mit tumorösen und nicht tumorösen Bestandtei- len durch seine Tochterzellen wieder aufbauen (Clarke et al. 2006). Zweitens haben sie das Potenzial, einen Tumor in einer immundefizienten Maus zu initiieren. Außerdem können sie drittens über mehrere Generationen transplantiert und wieder angezüchtet werden. Vier- tens haben sie besondere Marker auf ihrer Oberfläche, durch welche sie von anderen Tu- morzellen separiert werden können (Pardal et al. 2003; Clarke und Fuller 2006; Wicha

et al. 2006; Dalerba et al. 2007; Prince und Ailles 2008). Mittlerweile wird oft noch eine fünfte Eigenschaft genannt, welche eine Widerstandsfähigkeit gegenüber gängigen Chemo- therapeutika beinhaltet (Lim et al. 2011). Grundlage hierfür ist, dass adulte Stammzellen eine Resistenz gegen Giftstoffe besitzen. Dies geschieht unter anderem durch geringe Pro- liferationsraten, Bereitstellung von Proteinen zur DNA-Reparatur oder den Transport von schädlichen Stoffen aus der Zelle heraus, beispielsweise durch ATP-binding cassette trans- porter (Dean et al. 2001; Shen et al. 2013). Zudem haben Tumorstammzellen und mesen- chymale Zellen jeweils, im Gegensatz zu Epithelzellen, die Fähigkeit zur Migration ent- lang der Extrazellulärmatrix (Hay 1995). Die Tumorstammzellhypothese hat eine enorme Bedeutung für das Verständnis des Verlaufs einer Tumorerkrankung und damit für den Ein- satz therapeutischer Strategien. Durch die Fähigkeit der Selbsterneuerung können Tumor- stammzellen Metastasen bilden. Überlebt nur eine Zelle, so kann nach chirurgischer, Ra- dio- oder Chemotherapie ein Rezidiv auftreten, aufgrund des Status der Quieszenz gegebe- nenfalls erst Jahre nach der Therapie (Chen et al. 2011).

Es stellt sich die Frage, wie die Zellen mit Tumorstammzelleigenschaften in Karzino- men entstehen. Eine Möglichkeit ist, dass adulte Stammzellen des Gewebes Mutationen entwickeln, die Grundlage für einen bösartigen Tumor werden (Pardal et al. 2003; Brabletz 2012). Andererseits könnten sich Tumorstammzellen aus normalen epithelialen Tumorzel- len entwickeln. Es gibt immer mehr Belege dafür, dass Letzteres mit Hilfe von epitheli- al-mesenchymaler Transition geschieht. Der resultierende mesenchymale Phänotyp könnte nicht nur die erste Hauptphase mit seinen neu gewonnenen Eigenschaften wie Invasivität und Fähigkeit zur Migration absolvieren, sondern auch die zweite Phase der Kolonisation (Morel et al. 2008; Singh und Settleman 2010; Chaffer und Weinberg 2011; Hanahan und Weinberg 2011; da Silva et al. 2015). Durch Stimulation aus den umgebenen Zellen und aus dem umliegenden Stroma wird der mesenchymale Phänotyp induziert (Chaffer und Weinberg 2011).

Zur Selektion von Tumorstammzellen in vitro gibt es verschiedene Möglichkeiten, bei denen die genannten Eigenschaften genutzt werden. Eine Option ist die Sphäroidkultur: In einer serumfreien Zellkultur mit Böden ultraniedriger Adhäsion können epitheliale Zellen aufgrund ihrer Eigenschaften nicht wachsen. Ohne Serum findet keine Differenzierung der Zellen statt, aber die hinzugegebenen Wachstumsfaktoren fördern die Vermehrung (Satpute et al. 2013). Es wird davon ausgegangen, dass durch klonales Wachstum aus jeweils einer Tumorzelle ein Tumorsphäroid entstehen kann (Weiswald et al. 2015). Die resultierenden

Zellen besitzen nachgewiesenermaßen Tumorstammzelleigenschaften (Lim et al. 2011;

Weiswald et al. 2015; Shaheen et al. 2016). Eine Alternative zur Selektion von Tumor- stammzellen ist die Erzeugung einer Untermenge von Zellen in der Durchflusszytometrie, welche als Side Population bezeichnet wird. Diese Zellen besitzen an ihrer Oberfläche Pro- teine der Familie der ATP-binding cassette transporter, die zuvor inkubierte Fluoreszenz- farbstoffe wie Hoechst 33342 wieder aus der Zelle heraus transportieren können. Damit würden sie in der Durchflusszytometrie als negativ selektiert werden (Goodell et al. 1996;

Behbod und Vivanco 2015).

1.2.4 E-Cadherin als epithelialer Marker

Cadherine sind eine große Gruppe von transmembranen Glykoproteinen, welche an verschiedenen Zellverbindungen, wie zum Beispiel Zonula adhaerens, Desmosomen, endothelialen und kardialen Junctions, beteiligt sind (Wheelock und Johnson 2003). Der extrazelluläre Teil baut eine Verbindung mit dem auf der Nachbarzelle präsentierten Cadherin auf, während der intrazelluläre Teil über weitere Proteine an das Zytoskelett bindet oder Signale weiterleitet (Goodwin und Yap 2004; Jeanes et al. 2008).

E-Cadherin ist eines der Hauptproteine auf Epithelzellen zur Ausbildung einer junktionalen Zonula adhaerens und ist über ß-Catenin mit dem Aktin-Zytoskelett der Zelle verbunden (Bánkfalvi et al. 2002; Wheelock und Johnson 2003; Scanlon et al. 2013).

Durch diese calciumabhängigen Zell-Zell-Kontakte kann sich die Zellpolarität im Epithel ausbilden (Cavallaro und Christofori 2004). Es scheint einen Zusammenhang zwischen der Expression von E-Cadherin und Tumoreigenschaften zu geben. Wird der Verlust von E-Cadherin induziert, kann dies zu Tumorinitiierung, Invasion und Metastasierung führen (Derksen et al. 2006; Jeanes et al. 2008; Nijkamp et al. 2011). Wird dagegen E-Cadherin in einer invasiven Zelllinie transfiziert, vermindert sich ihre Fähigkeit zur Invasion (Vle- minckx et al. 1991).

1.2.5 CD44 als Tumorstammzellmarker

Ein Marker für Tumorstammzellen von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs ist CD44 (Prince et al. 2007; Shen et al. 2013). CD44 ist ein Oberflächenglykoprotein, wel- ches hauptsächlich als Ligand zur Hyaluronsäure in der Extrazellulärmatrix dient (Goodi- son et al. 1999). Des Weiteren bindet es an Kollagen, Fibronectin, Laminin und Osteopon- tin (Naor et al. 1997). Es treten zwei Isoformen auf: CD44s für die Standard- und CD44v

für die Variantisoform. Diese Formen entstehen durch alternatives Splicing und lassen sich anhand der verwendeten Exone in weitere Untergruppen einteilen (Tölg et al. 1993; Todaro et al. 2014). Exprimiert wird CD44 auf hämatopoetischen, mesenchymalen und einigen epithelialen Zellen (Hanagiri et al. 2012; Shen et al. 2016). Es ist beteiligt an der Anregung zur Aggregation, Zellproliferation, Migration und Angiogenese (Hanagiri et al. 2012; Shen et al. 2016). Lymphozyten können CD44 zur Fortbewegung in der Extrazellulärmatrix ver- wenden und aktivierte T-Lymphozyten können darüber an Endothelzellen von Gefäßen binden und diese verlassen (DeGrendele et al. 1997; Estess et al. 1998; Goodison et al.

1999).

1.3 Fragestellung

Zielsetzung der Arbeit ist der Vergleich von Primärtumor und Metastase eines Plattenepi- thelkarzinoms des Hypopharynx in Hinblick auf die Tumorstammzelleigenschaften sowie die epithelial-mesenchymale Transition. Hierzu ergaben sich folgende Fragen:

1. Inwieweit unterscheiden sich Primärtumor, Lymphknotenmetastase, primäre Zellkultur und Sphäroidkultur in der Ausprägung der EMT?

2. Eignet sich die Sphäroidkultur als Selektion für eine Zellpopulation mit Tumorstammzelleigenschaften beziehungsweise mit einem mesenchymalen Phänotyp?

3. Wie sehr eignet sich der Verlust von E-Cadherin als Marker für EMT in Primärtumor, Lymphknotenmetastase, primärer Zellkultur sowie Sphäroidkultur?

4. Ist CD44 dafür geeignet um im Primärtumor, in einer Lymphknotenmetastase sowie in der Zellkultur und Sphäroidkultur des Primarius die Tumorstammzellen zu detektieren?

5. Welche Veränderungen in der Genexpression gehen mit CD44 einher?

2 Material und Methoden

Im folgenden Kapitel werden die verwendeten Methoden dargestellt. Eine genaue Auflis- tung aller Materialien befindet sich im Anhang I - VIII.

2.1 Ethik

Die Genehmigung des Tierversuchantrages erfolgte am 01.02.2010 unter dem Geschäfts- zeichen 33.14-42502-04-13/1105 durch das Niedersächsischen Landesamt für Verbraucher- schutz und Lebensmittelsicherheit, LAVES, Postfach 3949, 26029 Oldenburg.

Die Entnahme von Gewebe wurde von der verantwortlichen Ethikkommission der Universitätsmedizin Göttingen, Von-Siebold-Straße 3, 37075 Göttingen, unter dem Ge- schäftszeichen 9/12/10 autorisiert.

2.2 Gewinnung und Konservierung von nativen Gewebeproben

Die in dieser Arbeit untersuchten Gewebeproben wurden im Rahmen einer kurativen Tu- moroperation im Operationssaal entnommen und direkt in das Labor überführt. Nach dem Transport erfolgte unter steriler Abluft in einer Petrischale zunächst die makroskopische Reinigung der Probe von Bindegewebe, Nekrosen, Verbrennungen oder Ähnlichen. An- schließend wurde die Probe je nach gewünschter Größe zerteilt und weiter verwendet.

2.2.1 Konservierung für die Genexpressionsanalyse

Für die Konservierung für die Genexpressionsanalyse erfolgte schnellstmöglich die Beför- derung von drei 1 mm³ großen nativen Proben zusammen mit 1 ml RNAlater in ein 2-ml-Eppendorfgefäß. Diese wurde über Nacht bei 4 °C gekühlt und anschließend bei -20 °C eingefroren, um sie später für Genexpressionsanalysen zu verwenden.

2.2.2 Konservierung für Immunhistochemie

Ein weiterer Block von 0,5 cm³ bis 1 cm³ großen Proben wurde für immunhistochemische Färbungen über Nacht in 10 ml 4,5%iges Formalin eingelegt. Eine Weiterverarbeitung der Probe erfolgte am nächsten Tag.

2.3 Xenograft-Modell

2.3.1 Tierpflege

Die in den vorliegenden Untersuchungen verwendeten Mäuse wurden in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung (ZTE) der Universitätsmedizin Göttingen gehalten. Alle Tiere wurden in 1500 cm² großen IVC-Käfigen verwahrt. Die NOD-SCID-Mäuse erhielten sowohl bestrahltes Futter als auch gefiltertes Wasser, wohingegen NMRI-nu-Mäuse norma- les Futter und Wasser bekamen. Käfige, Futter und Wasser wurden wöchentlich gewechselt. Die Gruppengrößen beinhalteten vier Mäuse pro Käfig.

2.3.2 Implantation des Tumors

Die Implantation von Gewebe als Xenograft in immundefiziente Mäuse erfolgte wie be- reits von Morton und Houghten (2007) sowie Canis et al. (2013) beschrieben.

Nach der Gewinnung wurden Gewebeproben mit einen Durchmesser von bis zu 2 mm in ein 15-ml-Röhrchen überführt und mit 3 ml Nährlösung (s. Anhang VIII: Medium der primären Zellkultur) bedeckt. Anschließend erfolgte die Narkose der immunsupprimierten Maus mit 3 ml/min Sauerstoff und 6 Volumen/% Sevofluran. Die Narkose wurde mit einer Erhaltungsdosis von 3 ml/min Sauerstoff und 3 Volumen/% Sevofluran fortgesetzt.

Die Implantation erfolgte zwischen den Schulterblättern und auf dem kaudalen Teil des Rückens in der Medianlinie. Zunächst wurden die Bereiche desinfiziert. Anschließend er- folgte ein 2 mm langer horizontaler Schnitt im Operationsgebiet. Mit einer Präparations- schere wurde die Subkutanschicht der Haut in kranialer Richtung aufgespalten. In die nun entstandene Tasche wurde eine Gewebeprobe platziert und mit einem Tropfen ampicillin- haltiges Medium (Anhang VIII: Medium der primären Zellkultur) bedeckt. Danach erfolgte der Verschluss des Schnittes mit Einzelknopfnähten mittels resorbierbarem Nahtmaterial.

Anschließend wurde das Körpergewicht der Maus zum ersten Mal gemessen.

Als Schmerzmedikation bekamen die Mäuse 500 mg Metamizol in 500 ml Trinkwasser ab zwei Tage vor bis drei Tage nach der Operation verabreicht.

2.3.3 Verlaufskontrolle

Als Verlaufskontrolle erfolgte wöchentlich die Messung des Gewichts der Tiere und der Größe der Proben. Dabei wurde auch auf eventuelle Infektionen und weitere Auffälligkei- ten geachtet. Der Durchmesser der Transplantate wurde in kranio-kaudaler sowie in hori-

zontaler Richtung mit einem Messschieber gemessen. Aus den beiden Werten erfolgte die Berechnung des mittleren Durchmessers. Als angewachsen galt eine Probe, wenn sie sich um mehr als 0,7 mm pro Woche über drei Wochen vergrößerte oder langfristig einen mittleren Durchmesser größer als sieben Millimeter erreichte.

Die NOD-SCID-Mäuse wurden für die Messungen sediert. Im Gegensatz dazu konnten die NMRI-nu-Mäuse unter steriler Abluft und wach gemessen werden.

2.3.4 Gewinnung von Xenotransplantaten

Jedes Transplantat mit einem mittleren Durchmesser über 9 - 10 mm wurde entnommen.

Dafür wurde die Maus zunächst durch Einleiten von 10 ml/min CO2 in einen Käfig eutha- nasiert und zusätzlich durch einen Genickbruch sicher getötet. Anschließend erfolgten die letzten Messungen des mittleren Durchmessers des Implantats und Fotografien der Maus von der Seite und von oben. Schließlich wurden die Tumore unter sterilen Bedingungen entnommen, vom restlichen Bindegewebe befreit und in eine Petrischale überführt. Es wur- den wie bei den nativen Gewebeproben Anteile für Immunhistochemie, Genexpressions- analyse und Xenotransplantation gesichert.

2.3.5 Dissoziation in Einzelzellen

Die Dissoziation der Xenotransplantate in Einzelzellen wurde mit dem gentleMACS^TM- Dissoziator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) nach einem standardisier- ten Protokoll des Tumor Dissociation Kit, human von Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland) durchgeführt.

Zur Vorbereitung wurden die einzelnen Lösungen zubereitet. Hierfür wurde Lösung I mit 3 ml komplettiertem Airway-Epithelial-Cell-Growth-Medium (kAECG-Medium, An- hang VIII) gelöst und in 200 µl Portionen in Eppendorfgefäße gefüllt. Bei Lösung II er- folgte die Lösung in 2,7 ml desselben Mediums und wurde in 100 µl Rationen portioniert.

Lösung III wurde mit 1 ml Reconstition Buffer zubereitet und jeweils 25 µl pro Eppendorf- gefäß abgefüllt. Die so hergestellten Ansätze wurden bei -20 °C bis zu ihrer Verwendung gelagert. Vor Dissoziationsbeginn wurde ein gentleMACS^TM C-Tube (Miltenyi Biotec, Ber- gisch Gladbach, Deutschland) pro Transplantat mit 4,7 ml kAECG-Medium (Anhang VIII) und je einer Portion der Lösungen I, II, III befüllt.

Für die Herstellung der Zellsuspensionen erfolgte zunächst eine Desinfektion der noch unzerschnittenen Gewebeprobe mit Schleimhautdesinfektionsmittel. Danach wurde sie mit

einem Skalpell auf eine Größe von 1 mm³ zerkleinert und anschließend in das vorbereitete gentleMACS^TM C-Tube überführt. Nun erfolgte die Durchführung der drei von Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland) voreingestellten und standardisierten Programme des gentleMACS^TM-Dissoziator zur schrittweisen Herstellung einer Zellsuspension. Als Er- stes wurde h_Tumor_01 verwendet, im Anschluss das C-Tube für 30 Minuten im Inkubator aufbewahrt und alle 10 Minuten vorsichtig geschüttelt. Hinterher erfolgte die Ausführung des Programms h_Tumor_02 und die Inkubation wie zuvor. Nachdem das Programm h_Tumor_03 am Dissoziator durchgeführt wurde, ergab sich die gewünschte Zellsuspensi- on. Diese wurde über einen 70-µm-Filter von noch vorhandenen größeren Zellverbänden bereinigt und in ein 15-ml-Gefäß überführt. Anschließend erfolgte die Durchspülung des Filters über einem zweiten Gefäß mit 10 ml Nährlösung. Die Zellsuspension wurde danach 10 Minuten lang bei 1200 upm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet konnte nun zur Etablierung einer Zellkultur verwendet werden.

2.4 Zellkultur

Für die Zellkultur war der Inkubator auf eine Temperatur von 37 °C sowie 5 % CO2 einge- stellt.

2.4.1 Etablierung einer Zellkultur

Die frisch dissoziierten Zellen im Pellet wurden in kAECG-Medium gelöst und auf 50-ml- und 250-ml-Zellkulturflaschen verteilt. Im Anschluss erfolgte die Lagerung im Inkubator für vier bis sieben Tage. Nach ein bis zwei Wochen wurden im kAECG-Medium noch 10 % FKS ergänzt. Anschließend erfolgte die Umstellung der primären Zellkultur in meh- reren Verdünnungsschritten auf ein Medium mit DMEM/RPMI als Grundlage (An- hang VIII: Medium der primären Zellkultur). Dies wurde je nach Verbrauch und Füllung der Flaschen alle zwei bis drei Tage gewechselt.

Eine Passagierung der Zellen erfolgte entweder bei Platzmangel oder spätestens nach vier- bis fünfmaligem Öffnen der Zellkulturflaschen. Hierfür wurde zunächst eine Einzel- zellsuspension hergestellt, um die Zellen zählen zu können. Anschließend erfolgte die Pi- pettierung der Zellen in neue Zellkulturflaschen und das Auffüllen mit Nährlösung.

2.4.2 Herstellen von Einzelzellsuspension

Einzelzellsuspensionen wurden auf verschiedenen Wegen gewonnen, je nachdem wie in- tensiv die Zellen aneinander und am Flaschenboden hafteten.

Eine in dem Labor übliche Trypsinierung für weniger stark haftende Zellen erfolgte zu- nächst durch Abgießen der Nährlösung. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, in- dem je nach Flaschengröße 1,5 - 3 ml PBS über den Flaschenboden gegeben und wieder abpipettiert wurde. Hinterher wurde 1,5 - 3 ml 0,07%ige Trypsinlösung (Anhang VIII) in die Zellkulturflasche gegeben und etwa fünf Minuten im Inkubator aufbewahrt. Nach mehrmaligem Klopfen hatten sich die Zellen gelöst. Anschließend wurde die gewünschte Menge mit dem jeweiligen Medium aufgefüllt.

Indessen erfolgte bei stark haftenden Zellen nach dem Abgießen des Mediums erst das Waschen mit PBS und anschließend die fünfminütige Inkubation in 1,5 - 3 ml EDTA- Lösung (Anhang VIII). Nachdem diese abpipettiert worden war, wurde 1,5 - 3 ml 0,05%ige Trypsinlösung hinzugegeben und die bedeckten Zellen fünf Minuten im Inkuba- tor gelagert. Anschließend wurde die gewünschte Menge mit dem jeweiligen Medium auf- gefüllt.

2.4.3 Zählen der Zellen

Zur Vorbereitung zum Zählen von Zellen wurden die Trägerstege einer Neubauer-Zählkam- mer vorsichtig angefeuchtet, ein Deckglas auf sie aufgelegt und eine ausreichende Adhäsi- on sichergestellt. Es war darauf zu achten, dass sich Newtonsche Interferenzringe zeigten und das Deckglas mittig aufsaß, damit ein möglichst genaues Messvolumen gegeben war.

Anschließend wurde die Zellkultur in Einzelzellen dissoziiert und es erfolgte das Auf- füllen mit Nährmedium bis zur 10-ml-Grenze. Nach gutem Durchmischen wurde mit einer Pasteurpipette eine Probe entnommen und am Rand des Deckglases auf die Neubauer- Zählkammer aufgetragen. Dieser Vorgang wurde mit einer neuen Pasteurpipette auf der zweiten Seite der Zählkammer wiederholt.

Unter dem Mikroskop wurden alle Zellen in diesen Quadraten von oben nach unten ge- zählt, es sei denn, sie befanden sich auf der unteren oder rechten Begrenzungslinie. Aus beiden Zählungen der zwei Kammern wurde der Mittelwert gebildet und mit 10⁵ multipli- ziert. Die daraus resultierende Zahl wurde als Anzahl der Zellen in 10 ml betrachtet.

2.4.4 Trypanblaufärbung

Eine Typanblaufärbung diente dazu, lebende von toten Zellen zu unterscheiden, und erfolg- te nach Angaben des Herstellers. Zunächst wurden die Zellen mit ihrer Nährlösung abpipet- tiert und in ein 15-ml-Gefäß überführt. Anschließend erfolgte die zehnminütige Zentrifuga- tion bei 1200 upm, um danach den Überstand abzugießen. Nun wurden die Zellen mit einer Pipette gemischt und davon 200 µl in ein Gefäß befördert. Hinterher wurden noch 400 µl der 0,04%ige Trypanblaulösung in das Gefäß hinzugefügt. Nach erneutem Mischen erfolg- te das Zählen der Zellen.

Lebende Zellen konnten das Trypanblau nicht aufnehmen, leuchten dadurch weißlich, maximal hellblau, auf blauem Grund und hatten eine runde Form. Abgestorbene Zellen wa- ren blau.

2.4.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Ein Einfrieren von Zellen ist eine Möglichkeit, um Überschüsse für einen späteren Zeit- punkt zu konservieren. Hierfür wurde zunächst die Anzahl der Zellen zum Einfrieren be- stimmt. Für ein 2-ml-Probengefäß erfolgte die Separation von einer Million Zellen und im Anschluss die zehnminütige Zentrifugation bei 1200 upm. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen auf Eis in 1,8 ml kaltem Einfriermedium (Anhang VIII) aufgenommen. Die

Suspension wurde in ein Probengefäß überführt, mit -1 °C pro Minute in einer Einfrierbox langsam gefroren und bei -80 °C dauerhaft gelagert.

Zum Auftauen wurden die Probengefäße bei Raumtemperatur gelagert, bis sich der ge- frorene Inhalt von der Wand ablöste. Dieser wurde anschließend mit 10 ml Nährlösung für die jeweilige Zellart verdünnt. Nun erfolgte die Abzentrifugation des Einfriermediums für zehn Minuten bei 1200 upm. Nach der Resuspension der Zellen im gewünschten Medium wurden diese auf Zellkulturflaschen verteilt und im Inkubator aufbewahrt. Nach drei bis fünf Stunden wurde die Kultur kontrolliert. Hatten sich Zellen abgesetzt, wurde das über- stehende Medium in eine neue 50-ml-Flasche überführt und die Kultur mit den abgesetzten Zellen wieder aufgefüllt. Wenn sich keine Zellen abgesetzt hatten, stand die Kultur weitere zwölf Stunden im Inkubator. Am Tag nach dem Auftauen wurde noch einmal die Nährlö- sung gewechselt, um die verbliebenen Zelltrümmer zu beseitigen. Alle aufgetauten Zell- kulturen, die sich nicht innerhalb von 48 Stunden abgesetzt hatten, wurden verworfen.

2.4.6 Sphäroidkultur

Eine Sphäroidkultur wurde nach Chen et al. (2011) und Lim et al. (2011) durchgeführt.

Das Tumorstammzellmedium bestand aus serumfreien DMEM/F12 im Verhältnis 1:1 mit je 1 ml/100 ml Medium und den Zusätzen N-2 sowie B-27. Außerdem wurden die Wachstumsfaktoren EGF (recombinant human EGF, R&D Systems, Wiesbaden-Norden- stadt, Deutschland) und FGF (recombinant human FGF basic 146 aa, R&D Systems, Wies- baden-Nordenstadt, Deutschland) mit einer Konzentration von 20 ng/ml hinzugefügt (Lim et al. 2011).

Zunächst erfolgte die Bestimmung der Zellzahl der jeweiligen Zelllinie. Anschließend wurden 40 000 Zellen mit 3 ml Medium pro Kammer in 6-Kammer-Platten mit einer Ober- fläche mit ultraniedriger Adhäsion angesetzt. Im weiteren Verlauf wurden die Platten im In- kubator aufbewahrt. Alle zwei bis drei Tage wurde 0,5 ml Medium abpipettiert und 1 ml frisches Tumorstammzellmedium hinzugefügt. Die Differenz zwischen hinzugefügten und abpipettierten Medium glich sich dadurch aus, dass im Inkubator ein Teil der Nährlösung verdampfte.

Die Stammzellkulturen wurden regelmäßig mikroskopisch auf Sphäroide kontrolliert.

Waren diese in einer großen Anzahl vorhanden, erfolgte die Abpipettierung des gesamten Mediums einschließlich der Sphäroide aus der jeweiligen Kammer. Diese Suspension wur- de zehn Minuten lang bei 1200 upm zentrifugiert, um anschließend das Medium abzupipet-

tieren. Das verbliebene Pellet wurde in EDTA-Lösung gelöst, acht Minuten inkubiert und erneut wie zuvor zentrifugiert. Anschließend erfolgte das Lösen des Pellets in 0,07%iger Trypsinlösung und abermals eine Inkubation. Hierbei wurde die Zellsuspension alle zwei Minuten geschüttelt. Daraufhin erfolgte die Neutralisation des Trypsins mittels 10 ml FKS/PBS = 1/100. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Nachdem das PBS nach zehnminütiger Zentrifugation bei 1200 upm abpipettiert wurde, erfolgte diesmal die Lösung im gewünschten Medium, zum Beispiel Tumorstammzellmedium bei Repassagierung in der Sphäroidkultur. In einer Zählkammer wurde mikroskopisch kontrol- liert, ob alle Zellen voneinander dissoziiert waren. War dies nicht der Fall, erfolgte erneutes Mischen mit einer Pipette bis zum gewünschten Ergebnis. Nun konnten die Einzelzellen je nach Weiterverwendung übernommen werden.

2.5 Immunhistochemie

2.5.1 Kern-Plasma-Färbung von Zellen

Für eine Kern-Plasma-Färbung der Zellen wurde zunächst die Zellzahl der jeweiligen Zell- kultur ermittelt und eine Konzentration von 20 000 Zellen/100 μl für insgesamt 1,5 ml an- gestrebt. Dafür wurde die entsprechende Anzahl von Zellen entnommen, in ein 15-ml-Röhrchen überführt und zehn Minuten lang bei 1200 upm zentrifugiert. Im An- schluss erfolgte die Resuspension des Pellets in 1,5 ml PBS.

Anschließend wurde eine Zytozentrifuge (Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge, Thermo Scientific, Rockford, USA) zum punktförmigen auftragen von Zellen aus Zellsuspensionen auf Objektträger verwendet. Zuvor wurden ein Objektträger, eine gelochte Filterkarte und ein spezieller Trichter (Einfach-Cytofunnel^TM, Thermo Scientific, Rockford, USA) nach Anleitung des Herstellers zusammengesetzt und mithilfe eines Clips (Cytoclip^TM, Thermo Scientific, Rockford, USA) aneinander befestigt. Nach dem Einsetzen der Kon- struktion in den Rotorkopf wurden 100 µl (20.000 Zellen) der vorbereiteten Zellsuspension in die Öffnung des Trichters gegeben. Es folgte die fünfminütige Zentrifugation bei 1500 upm. Anschließend wurden die Objektträger zum Trocknen aufgestellt.

Zur Kern-Plasma-Färbung wurden die Zellen zunächst für mindestens zehn Minuten in Methanol auf dem Objektträger fixiert. Anschließend erfolgte das 15-malige Eintauchen der haftenden Zellen in Eosin (Diff Quik II, Medion Diagnostics, Düdingen, Schweiz) und danach in Methylenblau (Diff Quik I, Medion Diagnostics, Düdingen, Schweiz). Daraufhin wurden die Objektträger zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtempe- ratur luftgetrocknet.

2.5.2 Vorbereitung der Gewebeproben für die Immunhistochemie

Für eine immunhistochemische Färbung von Gewebeproben wurden in Formalin eingeleg- te native Tumorproben verwendet, welche durch Kooperationspartner paraffiniert und ge- schnitten wurden.

Die Einbettung in Paraffin erfolgte in fünf Schritten durch einen Färbeautomaten (Leica TP 1020, Leica, Nussloch, Deutschland). Jeder Schritt dauerte eine Stunde und sah zwei Wechsel der jeweiligen Lösung vor. Die Lösungen orientierten sich an einer aufsteigenden Alkoholreihe und bestanden aus (1) 70 % Ethanol, (2) 96 % Ethanol, (3) 100 % Ethanol, (4) Xylol, (5) Paraffin. Die entstandenen Paraffinblöcke konnten bei Raumtemperatur gelagert werden.

Zur weiteren Verarbeitung wurden die paraffinierten Gewebeproben mit einem Mikro- tom in 2 µm-Scheiben geschnitten und auf einen Objektträger gezogen. Anschließend wur- den sie für einige Minuten auf einer Wärmeplatte bei 37 °C zur Größenausdehnung gelegt und über Nacht ebenfalls bei 37 °C getrocknet.

Bevor Schnitte gefärbt werden konnten, mussten sie zunächst mit Hilfe einer absteigen- den Alkoholreihe wieder entparaffiniert werden. Dies geschah in fünf Schritten. Zuerst wurden die Objektträger für acht Minuten in Xylol, anschließend für zwei Minuten in 100 % Ethanol und als Drittes weitere zwei Minuten in 96 % Ethanol gelegt. Bei diesen drei Schritten wurde jede Lösung jeweils zweimal gewechselt. Danach erfolgte die Bettung für zwei Minuten mit einmaligem Wechsel in 75 % Ethanol. Abschließend wurden die Schnitte dreimal mit deionisiertem Wasser gespült.

2.5.3 Kern-Plasma-Färbung der Gewebeproben

Für eine Kern-Plasma-Färbung wurden die Schnitte zuerst entparaffiniert, für fünf Minuten in Hämalaun deponiert und anschließend für fünf Minuten in warmen Leitungswasser ge- bläut. Hinterher wurden sie mit Eosin für 30 Minuten gefärbt. Nachdem die Schnitte mit deionisiertem Wasser gewaschen wurden, erfolgte die Paraffinierung in umgekehrter Rei- henfolge analog zur Entparaffinierung.

2.5.4 Färbungen der Gewebeproben mit E-Cadherin und CD44

Für immunhistochemische Färbungen der entparaffinierten und geschnittenen Gewebepro- ben mit E-Cadherin und CD44 wurden mit dem SAView^TM IHC kit (Enzo^® Life Sciences, Farmingdale, USA) und nach dessen Protokoll angefertigt.

Zunächst wurden die entparaffinierten Schnitte in einem mit Citratpuffer gefüllten Fär- betrog gestellt und für 45 Minuten im Dampfgarer erhitzt. Währenddessen konnte die AEC-Substrate/Chromogen-Lösung hergestellt werden. Hierfür wurden 5 ml deionisiertes Wasser mit je zwei Tropfen AEC-Substrate-Buffer, AEC Chromogen und 3 %ige H2O2-Lö- sung (Substrat) versehen und nach jedem Schritt gemischt. Nachdem die Schnitte im An- schluss 20 Minuten bei Raumtemperatur ausgekühlt waren, erfolgte das mehrmalige Wa- schen dieser mit deionisiertem Wasser und die Überführung in Tris Buffer für fünf Minu- ten. Anschließend wurden die Schnitte mit 1 - 2 Tropfen 0,3%iger H2O2-Lösung (Peroxida- se Block im Verhältnis 1:10 mit deionisierten Wasser verdünnt) betropft, um endogene Per- oxidasen zu hemmen. Die Einwirkzeit betrug fünf Minuten in einer Befeuchtungskammer.

Nach dreimaligem Waschen in Tris Buffer erfolgte die 15-minütige Inkubation in der Be- feuchtungskammer mit 1 - 2 Tropfen Antikörperlösung. Die Antikörperlösung bestand aus Verdünnungsmittel für Antikörper (Antikörperdiluent) und konzentrierten primären Anti- körper. Sie wurden nach Herstellerangaben im Verhältnis 200:1 gemischt. Die Negativ- kontrolle wurde mit dem reinem Verdünnungsmittel betropft und in den folgenden Schrit- ten alleine gewaschen. Nach fünf Minuten in Tris Buffer erfolgte die zehnminütige Inkuba- tion mit biotinylierten sekundären Antikörpern (Linker Reagent). Nach erneutem Waschen in Tris Buffer wurden die Schnitte mit Streptavidin (Tracer Reagent) versehen und für 15 Minuten im Dunkeln in einer feuchten Kammer stehen gelassen. Anschließend wurden die Schnitte wiederholt in Tris Buffer gewaschen. Daraufhin erfolgte die Zugabe von 1 - 2 Tropfen vom AEC-Substrat/Chromogen-Lösung auf die Schnitte und die Inkubation für fünf Minuten in der Befeuchtungskammer. Nach dreimaligem Waschen in deionisier- tem Wasser wurden die gefärbten Schnitte für zwei Minuten in Hämalaun gelegt und im Anschluss für weitere zwei Minuten in warmen Leitungswasser gebläut.

Zuletzt wurden die Schnitte mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe wieder paraffinert und mit Eindeckmittel und einem Deckglas abgedeckt.

2.6 Durchflusszytometrie

Eine Durchflusszytometrie wurde genutzt, um die Oberflächenproteine CD44 und E-Cadherin quantitativ auf Zellen zu bestimmen.

Zunächst wurden die primäre Zellkultur und die Sphäroidkultur in Einzelzellen dissozi- iert und gezählt. Hiervon wurden 125 000 Zellen in je ein Eppendorfgefäß überführt. Insge- samt erfolgte dieser Vorgang dreimal pro Zellkultur, einmal für jeden Antikörper und eine Negativkontrolle. Die Eppendorfgefäße wurden bei 1000 g 10 Minuten zentrifugiert, um anschließend den Überstand abzupipettieren und das Pellet in 400 µl PBS zu lösen. Darauf- hin erfolgte entsprechend den Herstellerangaben die Hinzugabe von 5 µl pro Gefäß von Phycoerythrin (PE)-konjugierten CD44 oder E-Cadherin-Antikörpern beziehungsweise von PBS bei der Negativkontrolle. Anschließend wurden die Proben für 20 - 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einer erneuten zehnminütigen Zentrifugation bei 1000 g wurde der Überstand verworfen und die Zellen mit PBS gewaschen. Daraufhin erfolgte das Lösen der Zellen in 500 µl PBS. Nach Durchmischung wurden 400 µl der Zelllösung in ein 5-ml-Test-Röhrchen überführt und auf Eis gestellt.

Bei der Messung am Durchflusszytometer (BD FACS Canto^TM II Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, USA) wurde zunächst mit den ungefärbten Proben begonnen.

Es erfolgte die Festlegung eines Bereiches (gating), der nur einzelne Zellen und keine Zell- trümmer oder Zellverbände enthielt. Anhand der Negativkontrolle wurde auch der negative Bereich für alle weiteren Proben festgelegt. Anschließend erfolgte die Messung der mit An- tikörper gefärbten Proben anhand ihrer Fluoreszenzintensität. Es wurde der blaue Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm verwendet und eine Anzahl von 10 000 Events gezählt.

2.7 Genexpressionsanalyse

Die Genexpressionsanalyse wurde in Zusammenarbeit mit dem Transkriptomanalyselabor der Universität Göttingen durchgeführt. Durch dieses erfolgte die Verarbeitung sowie die Datenanalyse, die Herstellung der Hauptkomponentenanalyse und die Dendrogramme.

2.7.1 Herstellung der Proben aus Zellkulturen

Für eine Genexpressionsanalyse aus einer Zellkultur wurden mindestens 700 000 bis 1 Million Einzelzellen für zehn Minuten bei 1200 upm abzentrifugiert. Nach einer Wa- schung mit PBS und erneuter zehnminütiger Zentrifugation bei ebenfalls 1200 upm wurde der Überstand verworfen. Anschließend erfolgte die Lösung des Pellets in 1 ml RNAlater.

Dieses konnte direkt bei -20 °C eingefroren werden.

2.7.2 Verarbeitung von Proben im Transkriptomanalyselabor

Für eine Transkriptomanalyse wurde die Kits Low RNA Input linear Amplification Kit Plus, One Color (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) sowie Agilent RNA Spike-In Kit for One color (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) nach dem Standardprotokoll des Herstellers verwendet. Für die globale Expressionsanalyse wurde sich des Human 8×60 K design arrays (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) bedient.

Es wurden 200 ng der kompletten RNA als Startmaterial benutzt, um cDNA zu syntheti- sieren. Quantität und Effizienz der markierten und vermehrten cRNA wurden durch das Spektrophotometer gemessen. Die Hybridisierung erfolgte über 17 Stunden bei 10 upm und 65 °C. Die Arrays wurden gewaschen und gefärbt. Die Messung von Cy3-Intensitäten erfolgte durch einen Einfarbenscan unter Verwendung des DNA-Mikroarray-Scanners mit einer Auflösung von drei Mikrometer. Die gescannten Bilddateien wurden visuell auf Arte- fakte geprüft und anschließend analysiert.

2.7.3 Datenanalyse durch das Transkriptomanalyselabor

Eine Datenanalyse der Mikroarrays erfolgte in mehreren Schritten. Zunächst wurden die Arrays untereinander normalisiert. Im Anschluss erfolgte globales Clustering und eine Hauptkomponentenanalyse (Principal Component-Analyse, PCA) sowie die Berechnung der Daten anhand eines linearen Modells. Nach der Darstellung von Genexpressionsunter-

schieden wurden Überrepräsentationen der unterschiedlich exprimierten Gene analysiert.

Mithilfe von Quantile-Normalisierung der log2-transformierten Intensitäten wurde eine Normalisierung der Arrays zueinander erreicht. Damit wurde sichergestellt, dass die Inten- sitäten zwischen den Arrays in gleicher Weise verteilt waren.

Für die Clusteranalyse wurde eine hierarchische Annäherung unter Verwendung der Average-Linkage-Methode durchgeführt. Die Messung der Entfernungen erfolgte als 1-Pearson's-Korrelationskoeffizient. Die PCA wurde mittels der princomp-Funktion in der Software R erstellt. Um die durchschnittlichen Gruppenwerte für jedes Gen und die unter- schiedliche Genexpression einzuschätzen, erfolgte die Anpassung der Daten an ein lineares Model. Außerdem wurden die mittleren Gruppenwerte und die Standardabweichung für je- des Gen bestimmt. Um die Gene zu finden, die beim Vergleich der Gruppen einen signifi- kanten Unterschied in der Expression aufweisen, wurde eine empirische Bayes-Statistik auf die Daten angewandt. Dadurch konnte der Standardfehler der geschätzten Werte gemil- dert werden.

Nun wurden p-Werte über eine moderierte t-Statistik ermittelt und mithilfe der Benja- mini-Hochberg-Methode für multiple Testungen korrigiert. Die Anpassung des p-Wertes garantiert eine kleinere Anzahl von falsch positiven Ergebnissen bei der Kontrolle der false discovery rate (FDR, Falscherkennungsrate). Als Nullhypothese galt, dass es keine diffe- renzielle Expression zwischen den Abbaugraden gab. Diese wurde für jedes Gen verwor- fen, wenn sein FDR kleiner als 0,05 war. Um überrepräsentierte Funktionen, welche durch Gene Ontology Terms dargestellt wurden, zu finden, wurde das zusätzliche R-Paket topGO verwendet.

Die statistische Signifikanz der Vergleiche zwischen den unterschiedlichen Genlisten wurde durch den nichtparamatrischen Wilcoxon-Rangsummen-Test unter Verwendung der R-Bonferroni-Korrektur bestimmt. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant unterschiedlich gewertet.

2.7.4 Auswertung Mithilfe ausgewählter Gensets

Als eine weitere Möglichkeit der Genexpressionsanalyse wurde der Vergleich der Anreicherung von expremierten Genen mit schon bekannten Gensets durchgeführt. Hierfür wurden drei thematisch passende Genlisten aus der Molecular Signatures Database (MSigDB) (Subramanian und Tamayo et al. 2005; Liberzon 2014) ausgewählt. Mithilfe des Programms GSEA (gene set enrichment analyses; Subramanian und Tamayo et al. 2005)

erfolgte der Vergleich der Proben Tumor, Metastase, primäre Zellkultur und Sphäroidkultur anhand der Gensets (Einstellung: number of permutation: 1000; permutations typ: Pheno- type; collapse dataset to gene symbols: true). Als signifikant wurden Anreicherungen bei einem p-Wert < 5 % und FDR < 25 % angesehen.

3 Ergebnisse

3.1 Patientencharakteristika

Insgesamt wurden Proben von Primärtumoren und zugehöriger Lymphknotenmetastase von fünf Patienten verwendet. Die klinischen Charakteristika sind in den nachfolgenden Absät- zen dargestellt.

3.1.1 Patient H194

Der 62-jährige Patient H194 stellte sich mit seit drei Monaten bestehender Heiserkeit, Odyno- und Dysphagie sowie gelegentlicher Aspiration vor. Zudem bestand eine schmerz- hafte progrediente Schwellung zervikal links. Anamnestisch ergaben sich eindeutige Hin- weise auf Risikofaktoren wie einen Alkoholabusus mit bestehender Leberzirrhose sowie mangelhafte Mundhygiene. Des Weiteren hatte der Patient einen insulin- und metformin- pflichtigen Diabetes mellitus Typ 2, Hyperurikämie sowie einen arteriellen Hypertonus.

Beim Staging mit histopathologischer Untersuchung zeigte sich ein mäßig dif- ferenziertes, geringgradig verhornendes Plattenepithelkarzinom des Hypopharynx links. Es erfolgte eine transorale laserchirurgische Tumorresektion inklusive radikaler Neck dissection links in fünf und rechts in vier Regionen in kurativer Zielsetzung. Hierbei konnte links die Vena jugularis, der Nervus hypoglossus sowie der Nervus accessorius nicht erhalten werden. Die postoperative Tumorklassifikation betrug pT3 pN2c {19/47}

cM0 L1 V1 G2 R0, insgesamt Stadium IVA (UICC 2010). Im Anschluss erfolgte eine kombinierte Radiochemotherapie mit Cisplatin wöchentlich. Die Systemtherapie wurde bei Thrombozytopenie auf zwei Zyklen begrenzt. Zudem musste die Radiatio bei 58 Gy Gesamtdosis aufgrund einer neu aufgetretenen Abducensparese linksseitig unklarer Genese abgebrochen werden. Im weiteren Verlauf entstanden Lebermetastasen, metastasensuspekte pleuraständige, mediastinale sowie hiläre Raumforderungen. Zudem gab es Hinweise auf eine intrakranielle Metastasierung. Schließlich kam es zur akuten Verschlechterung des Allgemeinzustandes des Patienten bei linkshemisphärischem Subduralhämatom mit Mittellinienverlagerung, Liquoraufstau und Uncuseinklemmung. Trotz neurochirurgischer Intervention verstarb der Patient infolgedessen. Zu dem Zeitpunkt waren vier Monate seit der Diagnosestellung des Hypopharynxkarzinoms vergangen.

3.1.2 Patient H196

Der 72-jährige Patient H196 stellte sich mit seit vier Wochen bestehender Odynodysphagie vor. In der klinischen Untersuchung präsentierte sich eine gerötete, höckrige Vorwölbung der rechten Tonsille. Der Patient hatte bis 20 Jahre zuvor 20 pack years geraucht.

Beim Staging mit histopathologischer Untersuchung zeigte sich ein HPV-negatives, mä- ßig differenziertes, teils gering verhornendes Plattenepithelkarzinom der Tonsille rechts. Es folgte eine transorale transzervikale Tumorresektion inklusive Neck Dissection Level I - V beidseits. Die postoperative Tumorklassifikation nach UICC 2010 betrug pT3 pN0 {0/42}

cM0 L0 V0 G2, R0 reseziert, insgesamt Stadium III. Anschließend erfolgte eine adjuvante Radiochemotherapie mit Cisplatin wöchentlich und Bestrahlung der ehemaligen Tumor- region bis 61,2 Gy sowie der cervikalen, submandibulären und supraclavikulären Lymph- abflussgebiete beidseits bis 50,4 Gy. Bei den regelmäßigen Nachsorgeuntersuchungen fan- den sich in den nächsten fünf Jahren keine Hinweise auf ein Rezidiv.

3.1.3 Patient H200

Der 50-jährige Patient H200 wurde zur Abklärung einer computertomografisch weichteil- dichten Raumforderung im Hypopharynx rechts unklarer Dignität vorgestellt. Er berichtete über eine seit 18 Monaten bestehende progrediente Odynodysphagie sowie ein Fremdkör- pergefühl. In einer Panendoskopie konnte ein exophytisch wachsender Tumor im rechten Hypopharynx gesehen werden. Der Patient beendete vier Jahre vor Diagnosestellung sei- nen Nikotinkonsum und sechs Jahre zuvor seinen Alkoholabusus. Als Vorerkrankung hatte der Patient eine arterielle Verschlusskrankheit, welche bereits mit einem femoro-poplitea- len Bypass links und mehrfachen Stent-Implantationen in den rechten Beingefäßen sowie in der Arteria carotis links behandelt wurde.

Beim Staging mit histopathologischer Untersuchung zeigte sich ein mäßig differenzier- tes, partiell verhornendes Plattenepithelkarzinom des Hypopharynx rechts. Als operative Therapie erfolgte die Tumorresektion einschließlich selektiver Neck Dissection rechts Le- vel II a/b, III, IV und V und links Level II a/b, III und IV a sowie eine Nachresektion, da zunächst nur ein R1-Status erreicht wurde. Die abschließende postoperative Tumorklassifi- kation betrug cT3 (Operateur) pN2b {2/17} cM0 L1 V0 G2, R0 reseziert, insgesamt Stadi- um IVA (UICC 2010). Im Anschluss fand eine kombinierte Radiochemotherapie mit Be- strahlung des ehemaligen Tumorbettes inklusive des regionalen Lymphabflussgebietes und der Supraclavicularregion bis 64,0 Gy parallel mit Cisplatin wöchentlich statt.

Zweieinhalb Jahre später wurde eine pathologische Fraktur bei ossärer Metastase im Lendenwirbelkörper vier sowie eine tumoröse Raumforderung im rechten Lungenoberlap- pen mit mediastinalen und supraclavikulären suspekten Lymphknoten diagnostiziert. Es folgte eine dorsale Stabilisierung und Ersatz des betroffenen Wirbelkörpers sowie eine Nachbestrahlung bis 30 Gy. Ein Malignitätsnachweis der Raumforderung im rechten Lun- genoberlappen gelang nicht. Ausgehend von einem ossär und pulmonal metastasierten Hy- popharynxkarzinom wurde eine palliative Systemtherapie angeboten, die der Patient ab- lehnte. Fünf Monate später kam es zur zunehmenden Reduktion des Allgemeinzustandes mit Schwäche und Verwirrtheit bei Tumoranämie, -kachexie, Hyperkalziämie, steigenden Nierenrentionsparametern sowie Elektrolytentgleisung. Der Patient wurde stationär pallia- tivmedizinisch symptomkontrolliert behandelt und verstarb infolge der Verschlechterung drei Jahre nach der Erstdiagnose.

3.1.4 Patient H204

Der 75-jährige Patient H204 stellte sich mit seit mehreren Wochen bestehender Schwellung des Mundbodens beidseits vor. Enoral präsentierte sich eine exophytisch wachsende Raum- forderung des anterioren Mundbodens. Als Risikofaktor wies der Patient Nikotinabusus mit 80 pack years auf. Als Vorerkrankungen waren ein arterieller Hypertonus, insulinpflichtiger Diabetes mellitus Typ 2 sowie eine koronare Herzkrankheit (KHK) bekannt.

Beim Staging mit histopathologischer Untersuchung zeigte sich ein mittelgradig diffe- renziertes, nicht verhornendes Plattenepithelkarzinom des Mundboden. Es erfolgte eine enorale Tumorresektion sowie die Neck Dissection beidseits in fünf Regionen mit Defekt- deckung mittels Radialislappen links und Vollhaut aus der Leiste links. Die abschließende Tumorklassifikation betrug pT3 pN0 {0/16} M0 L0 V0 G2, R0 reseziert, insgesamt Stadi- um III (UICC 2010). Postoperativ erlitt der Patient einen kardiogenen Schock bei subaku- tem Vorderwandinfarkt bei schwerer 3-Gefäß-KHK und respiratorischer Insuffizienz. Es er- folgte die Rekanalisation der verschlossenen Koronararterie mittels Stenteinlage und eine intensivmedizinische Behandlung. Der Patient war vorübergehend dialyse- und katechola- minpflichtig. Aufgrund der Begleiterkrankungen wurde auf die formal indizierte adjuvante Radiochemotherapie verzichtet. Bei den regelmäßigen Nachuntersuchungen in den darauf folgenden fünf Jahren fanden sich keine Hinweise auf ein Rezidiv.

3.1.5 Patient H208

Der 62-jährige Patient H208 stellte sich mit einer seit drei Jahren vorhandenen Läsion am linken Unterrand der Zunge und dem seit fünf Wochen bestehenden Gefühl einer schlecht sitzenden Zahnprothese vor. Klinisch präsentierte sich eine gerötete, schuppige und exophytische Schleimhautläsion, welche weich palpabel war. Der Patient hatte 30 pack years geraucht und es bestand anamnestisch ein Alkoholabusus. Als Vorerkrankungen wies er ein Vorhofflimmern, eine KHK, einen arteriellen Hypertonus, eine chronisch obstruktive Ventilationsstörung, eine Leberzirrhose und eine chronische Niereninsuffizienz Grad IV mit Verdacht auf hepatorenalem Syndrom vor. Zudem hatte er zehn Jahre zuvor eine intrazerebrale Blutung sowie 35 Jahre zuvor eine septische Knochennekrose des rechten Unterkiefers erlitten.

Beim Staging mit histopathologischer Untersuchung zeigte sich ein mäßig differenzier- tes, gering verhornendes Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle. Es erfolgte eine Tumorre- sektion und funktionelle Neck dissection beidseits. Die postoperative Tumorklassifikation betrug pT2 pN0 {0/48} cM0 L0 V0 G2, R0 reseziert, Stadium II (UICC 2010). Zu diesem Zeitpunkt war keine Radio- oder Chemotherapie indiziert. Der Patient erlitt nur fünf Mona- te später ein lokales und regionales Rezidiv im Mundboden mit dem Stadium IVA mit rpT3 rcN2c cM0. Eine erneute Re-Neck Dissection sowie eine Radiotherapie lehnte der multimorbide Patient ab. Der Patient H208 war anschließend nicht mehr zu den HNO-ärzt- lichen Nachuntersuchungen erschienen.

3.2 Xenograft-Modell

Insgesamt wurden 28 humane Proben als heterotope Xenotransplantate subkutan bei NOD-SCID-Mäusen eingesetzt. Erfolgreich weitergeführt werden konnten Primärtu- morgewebe und Lymphknotenmetastase von einem Patienten. In einem zweiten Fall war dies nur mit Primärtumorgewebe möglich. Die weiteren gewonnenen Tumorproben konn- ten nicht fortgeführt werden (Tab. 1).

Tab. 1: Gewebeproben der I. Generation Patienten-

nummer Tumorstadium

des Patienten Gewebe- herkunft

Anzahl der angewachse-

nen Proben

Anzahl der nicht an- gewachsenen

Proben

Summe der implantierten

Proben H194.0 pT3 pN2c cM0

G2 Primärtumor 3 5 8

Lymphknoten 8 0 8

H196.0 pT3 pN0 cM0

G2 Primärtumor 0 6 6

Lymphknoten 0 6 6

H200.0 pT3 pN2b M0

G2 Primärtumor 2 2 4

Lymphknoten 0 4 4

H204.0 pT3 pN0 cM0

G2 Primärtumor 0 6 6

Lymphknoten 0 6 6

H208.0 pT2 pN0 cM0

G2 Primärtumor 0 4 4

Lymphknoten 0 4 4

Aus den angewachsenen Gewebeproben wurden wiederum Teile in NMRI-nu-Mäuse im- plantiert. Aus diesen Proben konnten sowohl aus der Metastase und dem Tumor von Pati- ent H194 als auch aus dem Tumor von Patient H200 eine weitere Generation angezüchtet werden (Tab. 2). Dies wurde bis zu viermal wiederholt. Bei allen drei weiteren Generatio- nen sind jeweils wieder Proben angewachsen.