Untersuchungen zum Epidermal Growth Factor Receptor - Status in Ependymomen: Vergleich von immunhistochemischen Färbungen und Floureszenz-in-situ-Hybridisierung

UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF

Institut für Neuropathologie

Direktor: Prof. Dr. med. Markus Glatzel

Untersuchungen zum Epidermal Growth Factor Receptor – Status

in Ependymomen: Vergleich von immunhistochemischen

Färbungen und Floureszenz-in-situ-Hybridisierung

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.

vorgelegt von: Larissa Kolevatova aus Berdjansk/Ukraine

Angenommen von der

Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 13.09.2011 Veröffentlicht mit Genehmigung der

Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.

Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. M. Glatzel Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: Prof. Dr. G. Sauter Prüfungsausschuss, dritte/r Gutachter/in: PD Dr. G. Thomalla

I

1 FRAGESTELLUNG

2 EINLEITUNG

2.1 Grundlagen zu Ependymomen ... 2

2.2 Immunhistochemische Routinediagnostik... 3

2.3 Genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen... 4

2.4 Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor ... 4

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Tumorkollektiv... 6 3.2 Tissue-Microarray-Herstellung ... 6 3.3 Immunhistochemische Färbungen ... 7 3.3.1 EGFR... 7 3.3.2 Mib-1... 8 3.3.3 p53... 9 3.4 Floureszenz-in-situ-Hybridisierung... 9 3.5 Statistische Analyse... 10

3.6 Isolierung von DNA und RNA... 11

3.7 EGFR-Mutationsanalyse... 12

4 ERGEBNISSE

4.1 Demographische Charakteristik der Kohorte ... 14

4.2 Kontrolle des TMA mittels Mib-1 und p53 ... 15

4.3 Expression von EGFR... 16

4.4 EGFR-Genstatus-Analyse... 16

4.5 Vergleich von immunhistochemischer EGFR-Expression und FISH... 19

4.6 Nachweis einer EGFR-Mutation... 20

5 DISKUSSION

6 ZUSAMMENFASSUNG

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

8 LITERATURVERZEICHNIS

9 DANKSAGUNG

10 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG

1 F

Ependymome sind vom Ependym ausgehende gliale Neoplasien ektodermalen Ursprungs. Pathogenese und prognostische Faktoren von Ependymomen sind noch nicht ausreichend geklärt. Man hat herausgefunden, dass der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) eine entscheidende Rolle in der Progression von Gliomen, insbesondere Glioblastomen, spielt. (Sjostrom et al. 2010) In Anlehnung dazu wollten wir den EGFR-Status bei Ependymomen untersuchen. Wir wollten herausfinden, ob Ependymome EGFR vermehrt exprimieren, und welche Methode am besten geeignet ist, den EGFR-Status zu ermitteln. Bis anhin wird er durch semiquantitative Messung von immunhistochemischen Färbungen bestimmt. Diese Methode ist zwar kostengünstig, jedoch auch anfällig für Störfaktoren. Deshalb wollen wir zusätzlich zur immunhistochemischen Analyse auch den Genstatus des EGFR-Gens mittels Floureszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) untersuchen. Für In-situ-Analysen ist ein Tissue-Microarray (TMA) sehr nützlich, weil damit alle Proben simultan mit einem Reagenz untersucht werden können. Damit bringt der TMA einen hohen Grad an Standardisierung auf, die eine wichtige Rolle in der Analyse der Proteinexpression oder des Genstatus spielt. Ferner wollten wir untersuchen, ob eine EGFR-Expression mit einer Mutation im EGFR-Gen einhergeht.

2 E

2.1 Grundlagen zu Ependymomen

Ependymome sind neuroektodermale, vom Ependym der Ventrikel, des Zentralkanals des Rückenmarks und Filum terminale ausgehende Tumoren. (Massimino et al. 2009) Ependymome machen rund 2-9 % aller neuroepithelialer Tumoren aus. Im Rückenmark lokalisierte Ependymome stellen die häufigste neuroepitheliale Neoplasie der Erwachsenen dar. Spinale Ependymome haben eine günstige Prognose. (Mendrzyk et al. 2006) Ependymome werden nach der Weltgesundheitsorganisation (WHO) in drei Grade unterteilt. Diese Klassifikation beruht auf der Annahme einer Entdifferenzierung, deren einzelne Stufen den Malignitätsgraden entsprechen. (Louis et al. 2007) WHO-Grad I Ependymome sind gutartig und langsam wachsend. Sie kommen überwiegend im

Conus-Cauda-Filum-terminale–Bereich vor. WHO-Grad II Ependymome sind langsam wachsende,

differenzierte und gut begrenzte Tumore im Bereich der inneren Hirnkammern oder des Rückenmarks. Typisches histologisches Merkmal sind perivaskuläre Pseudorosetten. WHO-Grad III Ependymome sind schnell wachsend mit deutlichen Zeichen der Malignität: erhöhte Zelldichte und Mitoserate, Kernpolymorphie, invasives Wachstum, Gefässproliferation, Nekrosen. Histopathologisch unterscheidet man myxopapilläre Ependymome und Subependymome (beide WHO-Grad I), zelluläre, papilläre, klarzellige, tanyzytische (WHO-Grad II) und anaplastische Ependymome (WHO-Grad III). (Louis et al. 2007) Mikroskopisch imponiert ein heterogenes Bild mit dem Kriterium der perivaskulären Pseudorosettenbildung, die jedoch in manchen Unterformen fehlen kann. (Burger et al. 2002) Daneben gehören zum „klassischen Erscheinungsbild“ auch die echten Rosetten mit Orientierung der Tumorzellen um ein virtuelles Zentrum. (Burger et al. 2002)

Klinisch stehen Hirndrucksymptome durch Liquorabflussstörungen im Vordergrund. (Kleihues et al. 2004) Operation und Bestrahlung sind die wesentlichen therapeutischen Optionen. (Timmermann et al. 2000) Da eine vollständige Resektion insbesondere im IV. Ventrikel selten gelingt, ist die Prognose insgesamt ungünstig. (Kleihues et al. 2004) Prognostische Faktoren wurden in Studien untersucht und beschränken sich auf den WHO Grad und das Ausmass der chirurgischen

Resektion. (Rodriguez et al. 2009) Somit besteht Bedarf nach neuen Prognosefaktoren und therapeutischen Optionen. (Green et al. 2009)

2.2 Immunhistochemische Routinediagnostik

Mit steigender Entdifferenzierung verlieren Ependymome ihr „klassisches“ Erscheinungsbild, sodass die Diagnose mittels immunhistochemischer Marker bestätigt werden muss. (Burger et al. 2002) Zum Einsatz kommen das epitheliale Membranantigen (EMA), welches an der Zelloberfläche der meisten epithelialen Zellen exprimiert wird, und saures Gliafaserprotein (GFAP), ein Intermediärfilament, welches vor allem in Astrozyten vorkommt. Dem Lumen zugewandte Zelloberflächen der echten Rosetten stellen sich EMA-positiv dar. (Burger et al. 2002) GFAP-positiv sind die Zellfortsätze, die die Tumorzellen der perivaskulären Pseudorosetten umgeben. (Burger et al. 2002)

Zur Einschätzung der Zellproliferation bestimmt man die Expression von Ki-67, ein nukleäres Protein, welches in Phasen G1 (Gap), S (Synthese), G2 (Gap) und M (Mitose) des Zellzyklus exprimiert wird. Bei teilungsfähigen Zellen wird der Eintritt in den Zellzyklus (G1-Phase) durch äussere Faktoren induziert, anschliessend kommt es zur Verdoppelung der DNA (S-Phase) und Vorbereitung (G2-Phase) auf die Mitose (M-Phase). Damit stellt Ki-67 einen Marker für Zellproliferation dar, die Detektion erfolgt mithilfe des monoklonalen Antikörpers Mib-1. Zur besseren Vergleichbarkeit wird der Mib-1-Proliferationsindex (Mib-1 LI) bestimmt. Er variiert in unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors. (Burger et al. 2002) Üblicherweise zeigen Grad III Ependymome einen höheren Mib-1 LI als WHO-Grad II Ependymome. (Burger et al. 2002)

Der Zellzyklus wird durch zahlreiche Faktoren reguliert, hier spielt der Tumorsuppressor p53 eine Schlüsselrolle. Seine Inaktivierung oder Mutation im p53-Gen können zum unkontrollierten Wachstum und Tumorentwicklung führen. (Böcker et al. 2004) Immunreaktivität ist sehr wahrscheinlich anzutreffen in WHO-Grad III Ependymomen. (Burger et al. 2002)

2.3 Genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen

Zahlreiche genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen konnten mittels Hybridisierungsmethoden aufgedeckt werden. Eine Studie untersuchte 26 Ependymome und fand eine 22q–Monosomie in 36 % der Fälle. Ferner fanden sie amplifiziertes N-MYC in zwei spinalen Ependymomen. (Scheil et al. 2001) Bei MYC handelt es sich um eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche die mRNA-Synthese regulieren. Desweiteren fand eine Gruppe eine Deletion der Chromosomen 17 und 22 bei Ependymomen. Dieser wurde eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Ependymome zugeschrieben, nämlich in der Inaktivierung der Tumorsuppressorgene. (Kramer et al. 1998) Ein wichtiger Vertreter der Tumorsuppressorgene ist TP53, welches auf dem Chromosomenort 17p13 lokalisiert ist und für den Transkriptionsfaktor p53 kodiert, welches bei irreparablen DNA-Schäden die Apoptose induziert. (Böcker et al. 2004) Bei spinalen Ependymomen konnte häufig eine Mutation im Neurofibromatose-Typ-2-Gen (NF2) beobachtet werden. (Kleihues et al. 2004) Eine andere Studie untersuchte die Genamplifikation in Ependymomen. Sie fand eine 0,34 Mb grosse Region am Chromosomenort 7p11.2, welcher den Genlocus von EGFR beinhaltet, hoch amplifiziert in einem und diskret amplifiziert in 24 von 68 Ependymomen. (Mendrzyk et al. 2006) Eine andere Studie untersuchte vier Ependymome mittels CISH (chromogenic in-situ hybridization) und konnte keine EGFR-Amplifikation feststellen. (Marquez et al. 2004)

2.4 Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor

Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor EGFR ist ein transmembraner Tyrosinkinase-Rezeptor für verschiedene Wachstumsfaktoren. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors führt zu seiner Dimerisierung. Dadurch kommt es zur Konformationsänderung des intrazellulären Teilabschnitts und Aktivierung der Tyrosinkinase. Es kommt zur Phosphorylierung von intrazellulären Substratproteinen, die eine intrazelluläre Signalkaskade (Ras, Raf, MAP-Kinase) in Gang setzen. (Zatloukal et al. 2004) Das Ergebnis ist Zellwachstum und Zellteilung. Daraus ist ersichtlich, dass EGFR eine ausschlaggebende Rolle bei der

Krebsentstehung spielt. (Girard et al. 2009) Amplifikationen im EGFR-Gen auf Chromosom 7 oder Mutationen der für die Tyrosinkinase kodierenden Domäne sind die Ursachen für eine gesteigerte Signalübertragung. (Ladanyi et al 2008) Die am häufigsten bei Gliomen beschriebene EGFR-Alteration ist die Deletion der Exons 2-7, die ein verändertes EGFR-Protein (EGFR variant III, EGFRvIII) zur Folge hat. (Jeuken et al. 2009) Die Signalübertragung durch Rezeptoren mit Tyrosinkinase kann auch pharmakologisch beeinflusst werden. Eine Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren konnte erfolgreich bei kolorektalen und Lungenkarzinomen eingesetzt werden. (Halatsch et al. 2006, Francoual et al. 2006) Deshalb wird die Identifikation von EGFR in Tumorzellen eine zunehmende Rolle in der neuropathologischen Diagnostik spielen.

Die Korrelation zwischen EGFR-Expression aus immunhistochemischer Untersuchung und EGFR-Genstatus ermittelt mit FISH wurde bisher noch nicht systematisch untersucht bei Epedymomen. Eine Gruppe fand eine diskrete Amplifikation in der Chromosomenregion 7p11.2, die den Genlokus für EGFR beinhaltet, in 24 von 68 Ependymomen und eine hohe Amplifikation bei einem Ependymom. (Mendrzyk et al. 2006)

3 M

M

3.1 Tumorkollektiv

Es wurden 55 Tumorproben untersucht, die aus dem Archiv des Instituts für Neuropathologie stammen. Das Gewebe stammt von Biopsien, die zwischen den Jahren 1991 und 2007 am Institut für Neuropathologie untersucht wurden. Alle Diagnosen entsprechend den Kriterien der WHO-Klassifikation wurden gemeinsam mit einem Neuropathologen bestätigt. (Louis et al. 2004) Davon entsprachen 40 Tumorproben dem WHO-Grad II Ependymom und 15 wurden als WHO-Grad III Ependymome klassifiziert. Für alle Analysen wurden die Patientendaten anonymisiert.

3.2 Tissue-Microarray-Herstellung

Die von Forschern des Instituts für Pathologie in Basel und des National Human Genome Research Institutes in Bethesda, USA (Olli Kallioniemi, Juha Kononen, Guido Sauter) entwickelte Gewebearray-Technik macht es erstmals möglich, eine standardisierte Untersuchung sämtlicher Tumorproben unter Verwendung eines Protokolls und gleicher Antikörper durchzuführen. Mit diesem Verfahren kann eine optimale Vergleichbarkeit der Daten erzielt werden. Für unsere Studie erfolgte die TMA-Herstellung anhand des bereits veröffentlichten Protokolls. (Dancau et al. 2010) Auf Basis der mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitte wurde die den Tumor am besten repräsentierende Region ausgewählt. Das entsprechende Areal wurde auf dem zugehörigen Paraffinblock markiert. Ein Gewebezylinder von 0,6 mm Durchmesser wurde aus der zuvor markierten Region ausgestanzt und in einem Empfängerblock aus Paraffin platziert. Zuvor wurden dafür im Empfängerblock Löcher in einem Abstand von 0,8 mm vorgefertigt. Nach Komplettierung des Tumorarrays wurden 3 µm dünne Schnitte mit dem Mikrotom für anstehende In-situ-Analysen angefertigt.

3.3 Immunhistochemische Färbungen

Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurde eine standardisierte indirekte Immunperoxidase-Methode verwendet. Dabei bindet ein unkonjugierter Primär-Antikörper an das Antigen. Anschliessend wird ein zweiter enzymgekoppelter Antikörper, der gegen das Fc-Fragment des Primär-Antikörpers gerichtet ist, aufgetragen. Es folgt die Substrat-Chromogen-Reaktion. Ein Enzym wird eingesetzt, das farblose Vorstufen von Chromogen in farbige Enzymprodukte umwandelt. Als Enzym wird eine Meerrettich-Peroxidase (HRP), als Chromogen 3.3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) verwendet. Die endogene Peroxidase wurde durch Inkubation des TMA in 3%igem Wasserstoffperoxid inaktiviert. Die Kernfärbung erfolgte mit Hämalaun mit anschliessender Spülung unter Wasser. Bei denen im Folgenden erwähnten Puffern handelte es sich um TBS- und TRIS-Puffer.

3.3.1 EGFR

Für die immunhistochemische Färbung von EGFR wurden zwei verschiedene Antikörper verwendet: EGFRpharmDX-Kit (Verdünnung 1:200, Dako, Glostrup, Dänemark) und clone 31G7 (Verdünnung 1:300, Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA). Die Vorgehensweise entsprach dem Protokoll der Hersteller. Nach EGFRpharmDX-Kit-Vorgaben wurde der Objektträger zur Entparaffinierung für 5 Minuten (min) in einem Xylolbad inkubiert, die überschüssige Flüssigkeit abgeklopft und für 3 min in reines Ethanol und danach für dieselbe Zeitdauer in 95%igen Ethanol getaucht. Anschliessend erfolgte eine Rehydrierung in Wasser für 5 min. Der TMA wurde mit Proteiniase K für 5 min vorbehandelt und anschliessend für 5 min im Wasserbad gespült. Danach wurde der TMA ausreichend mit Antikörper bedeckt und in der Feuchtigkeitskammer für 30 min inkubiert. Anschliessend erfolgte eine Spülung und Waschung im Pufferbad für 5 min. Der sekundäre Antikörper wurde dazu gegeben und der TMA erneut für 30 min in der Feuchigkeitskammer inkubiert und im Anschluss wie bereits erwähnt gespült. Danach wurde DAB für eine Einwirkzeit von 10 min dazu gegeben. Im Anschluss wurde der TMA wenige Minuten im Wasserbad gespült und mit Deckgläschen versehen.

Für den Färbevorgang mit dem Antikörper von Zymed wurde der TMA zur Entparaffinierung zuerst für 1 Stunde (h) in Xylol und anschliessend in absteigender Alkoholreihe (100%–, 96%–, 80%iger Ethanol) bis Aqua dest. getaucht. Daran schloss sich eine fünfminütige Pufferwaschung und Vorbehandlung mit dem Autoklav für 5 min an. Nach wiederholter Waschung ließ man den TMA für 10 min in 3%igem Wasserstoffperoxid inkubieren. Im Anschluss wurde der TMA erneut mit Puffer gespült. Schliesslich wurde der primäre Antikörper dazu gegeben, den man für 2 h bei 30 °C einwirken ließ. Danach wurde der TMA für 5 min im Puffer gewaschen und anschliessend mit der Polymer-HRP für 30 min bei 30 °C inkubiert. Es schloss sich zunächst eine zweimalige Spülung für je 5 min mit Puffer und dann mit Wasser an, bevor das Chromogen hinzu gegeben wurde. Der TMA wurde mit DAB für 10 min inkubiert und anschliessend mit Wasser und in aufsteigender Alkoholreihe (80%–, 96%–, 100%iger Ethanol) bis Xylol gespült, bevor er mit einem Deckgläschen versorgt wurde.

Die Auswertung erfolgte semiquantitativ entsprechend eines weit gebräuchlichen vierstufigen Scores mit (0): keine Membranfärbung; (1+): schwache, unvollständige Membranfärbung; (2+): schwache bis mäßige vollständige Membranfärbung in > 10 % der Tumorzellen; (3+): starke vollständige Membranfärbung in > 10 % der Tumorzellen. Ein Score von 0 und 1+ wurde demnach als negative EGFR-Expression, die Scores 2+ und 3+ als positive EGFR-Expression gewertet.

3.3.2 Mib-1

Für die Evaluierung des Proliferationsindex wurde der Antikörper für das Proliferationsantigen Ki-67 (clone SP6, Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:50, Neo Markers, Fremont, CA, USA) nach etabliertem Protokoll eingesetzt. Der TMA wurde zunächst in einer Pufferlösung mit pH 2,5 und danach in der Mikrowelle für 20 min vorbehandelt. Nach Abkühlung wurde der TMA für 5 min im Puffer gewaschen. Danach folgte die Inkubation in 3%igem Wasserstoffperoxid für 15 min. Der Überschuss wurde zweimalig für je 5 min im Puffer gespült. Anschliessend wurde der TMA mit im Puffer verdünntem Ziegenserum (1:10) für die Dauer von 30 min inkubiert. Danach wurde der primäre Antikörper, Mib-1, aufgetragen und für 2 h belassen, anschliessend wurde wieder im Puffer für 20 min gewaschen. Der

sekundäre Antikörper, ein biotinkonjugiertes Ziege-Anti-Maus-Ig, wurde in einer Verdünnung mit Puffer von 1:60 unter Zugabe von 20 µm Human-IgG dazu gegeben und für 40 min belassen. Anschliessend wurde der TMA für 10 min gewaschen. Im nächsten Schritt folgte die Zugabe von Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex. Nach 40 min wurde der TMA im Puffer erneut für 10 min gewaschen. Dann wurde das Chromogen zugefügt und für die Dauer von 10 min belassen. Darauf folgte ein zehnminütiger Waschvorgang mit Wasser.

Zur Bestimmung des Proliferationsindex (Mib-1 LI) wurden mindestens 200 Zellkerne pro Gewebsstanze gezählt, wobei positiv gefärbte Zellen zu nicht gefärbten in Verhältnis gesetzt wurden.

3.3.3 P53

Für die Markierung des p53 wurde folgender Antikörper verwendet: clone 318-6-11, Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:200, Dako, Glostrup, Dänemark. Der TMA wurde 20 min in der Mikrowelle unter Zugabe von 10 mM Zitrat und Pufferlösung deparaffinisiert und rehydriert. Anschliessend wurde der primäre Antikörper dazu gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde der TMA mit Puffer gespült und anschliessend mit Peroxidase für 90 min bei 4 °C inkubiert. Im nächsten Schritt wurde der TMA erneut mit Puffer gespült. Dann wurde DAB dazu gegeben und für 30 min belassen. Nach dem Färbevorgang wurde der Rest mit Wasser abgewaschen.

Analog der Bestimmung des Proliferationsindex wurden mindestens 200 Zellkerne pro Gewebestanze gezählt und die Ratio positiv markiert zu nicht markiert gebildet.

3.4 Floureszenz-in-situ-Hybridisierung

Für die FISH kamen folgende Sonden zum Einsatz: für das EGFR-Gen als Zielsequenz eine Spectrum-Orange–Sonde für die Region 7p12 und eine Centromersonde Spectrum-Green für die Region 7p11.1-q11.1 als Referenz (Abbott/Vysis, Inc., Downers Grove, IL, USA). Vor der eigentlichen Hybridisierung

IL, USA) vorbehandelt. Zunächst wurde der TMA bei 56 °C über Nacht im Brutschrank inkubiert. Zur Entparaffinierung wurde der TMA für 30 min in Xylol und anschliessend 10 min in 96%igen Ethanol getaucht. Nach dreiminütiger Trocknung auf der Heizplatte wurde das Pretreatment-Reagenz (Vysis, Downers Grove, IL, USA) aufgetragen und bei 80 °C für 15 min inkubiert. Danach wurde der TMA mit Wasser gespült. Im nächsten Schritt wurde Proteaselösung dazugegeben und bei 37 °C für 150 min belassen. Im Anschluss darauf erfolgte wieder eine Spülung mit Wasser. Darauf wurde der TMA in aufsteigender Alkoholreihe (70%–, 80%–, 96%iger Ethanol) jeweils 2 min gewaschen und anschliessend für 3 min auf der Heizplatte bei 48 °C getrocknet. Im nächsten Schritt wurde 10 µl DNA-Sonde auf das Gewebe pipettiert, mit Deckgläschen versehen und mit Rubberzement versiegelt. Die Sonde ist spezifisch für eine 300 kb lange Sequenz, welche das EGFR-Gen enthält. Die Centromersonden (centromere enumeration probe, CEP) sind spezifisch für hochrepetititve Sequenzen im Bereich der Centromeren. Im nächsten Schritt wurde der TMA zunächst für 5 min bei 72 °C und anschliessend über Nacht bei 37 °C im Hybrite-Gerät inkubiert. Am nächsten Tag wurden Kleber und Deckgläschen vorsichtig entfernt und der TMA ins Wasserbad für 2 min bei 72 °C gestellt. Danach wurde im Dunkeln für 15 min luftgetrocknet. Im nächsten Schritt wurde zur Gegenfärbung 10 µl 4′,6-Diamino-2-Phenylindol (DAPI) auf den TMA pipettiert und dieser mit Deckgläschen versehen.

Die Auswertung erfolgte manuell. Als Amplifikation wurde das Vorliegen von > 2 EGFR-Gensignalen als Centromersignale (EGFR/CEP7-Ratio > 2) in mindestens 10 % der Tumorzellkerne definiert. Zugewinne wurden definiert als Vorliegen von mehr EGFR– als CEP7-Signale in mindestens 50 % der Tumorzellkerne, wobei die Definition der Amplifikation nicht erreicht wurde (1 < EGFR/CEP7-Ratio < 2). Ein Normalbefund wurde dann angenommen, wenn keine der zwei oben genannten Definitionen erfüllt wurde (EGFR/CEP7-Ratio ≤ 1).

3.5 Statistische Analysen

Für die Untersuchung der Beziehung zwischen immunhistochemisch nachgewiesenem EGFR, dem EGFR-Genstatus ermittelt durch FISH und dem WHO-Grad wurde der χ2-Test durchgeführt.

3.6 Isolierung von DNA und RNA

Die DNA-Extraktion erfolgte aus Paraffinmaterial. Dazu wurden vom Paraffinblock drei bis fünf Scheiben von 8 µm Dicke mit einer sterilen Klinge geschnitten und in ein 2 ml Eppendorfgefäss gegeben. Nach Zugabe von 1 ml n-Oktan wurde das Gemisch für 10 min bei 65 °C inkubiert. Anschliessend wurde die Suspension 5 min bei 14000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment mit 1 ml Ethanol gemischt und anschliessend für 1 min bei 14000 U/min zentrifugiert. Auch dieser Überstand wurde verworfen und die Zentrifugation des Sediments unter Zugabe von Ethanol wiederholt. Im Anschluss wurde das Gemisch 10 min bei 37 °C getrocknet. Als nächstes wurde die Suspension in 100 µl Puffer und 10 µl Proteinase K gelöst und das Ganze 24 h bei 50 °C inkubiert. Danach gab man 50 µl Puffer und 5 µl Proteinase K dazu. Ausserdem wurde 450 µl Cleanmix binding solution (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) und 50 µl Cleanmix high capacity purification resin (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) hinzugefügt. Daraufhin wurde das Untersuchungsmaterial in ein steriles 2 ml Eppendorfgefäss mit Filter umgefüllt und 30 Sekunden (sec) bei 14000 U/min zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen, 250 µl Cleanmix washing solution (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) auf den Filter gegeben und erneut 30 sec zentrifugiert. Dann wurde dieser Schritt wiederholt. Das Filtrat wurde erneut verworfen. Als nächstes wurde 500 µl 80%igen Alkohol auf den Filter gegeben und erneut zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Filter vorsichtig herausgenommen und in ein steriles 2 ml Eppendorfgefäss gesteckt. Es wurden 50 µl Wasser auf 65-70 °C erhitzt und die DNA damit für 1 min eluiert und anschliessend zentrifugiert. Nach Entfernen des Filters wurde die Konzentration der DNA im Photometer bei 260 nm bestimmt.

Für die RNA-Isolierung wurden vom Paraffinblock Scheiben von 10 µm Dicke geschnitten und in ein 2 ml Eppendorftube gegeben. Zur Entparaffinierung wurde 1 ml Xylol auf die Proben gegeben und das Ganze 10 sec auf dem Vortex durchmischt. Das Gemisch wurde dann 2 min bei maximaler Umdrehungszahl zentrifugiert und der Xylolüberstand anschliessend abpipettiert. Nach erneuter Xylolzugabe und Zentrifugation wurden diese Schritte wiederholt. Nach Zugabe von 1 ml Ethanol wurde die Probe 2 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zentrifugation nach erneuter Ethanolzugabe wiederholt. Danach wurde die

Probe bei 37 °C im Thermoblock mit offenem Deckel getrocknet, bis kein Ethanolrückstand mehr vorhanden war. Dann wurde die Probe in 150 µl PKD-Puffer (Qiagen, Venlo, Niederlande) aufgenommen. Im nächsten Schritt wurde der Tube kurz in Stickstoff getaucht, sodass der Boden gefroren war, und anschliessend mit Eppendorf-Pistille zermörsert. Nach Zugabe von 10 µl Proteinase K wurde die Probe bei 55 °C im Wasserbad über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Gemisch für 15 min bei 80 °C im Thermoblock belassen. Im letzten Schritt wurden die Proben zusammen mit DNase in den QIAcube (Qiagen, Venlo, Niederlande) gegeben. Im Anschluss wurde die gewonnene RNA-Menge photometrisch vermessen.

3.7 EGFR-Mutationsanalyse

Für die EGFR-Sequenzierung wurde die zuvor aus dem in Paraffin eingebettetem Material isolierte DNA verwand. Die Exons 18, 19, 20 und 21, welche die Tyrosinkinase-Domäne des EGFR kodieren, wurden zunächst mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) nach gängigem Protokoll amplifiziert. (Schlomm et al. 2007, Lynch et al. 2004) Folgende Primer fanden Verwendung: Exon 18: 5′-CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC-3′ 3′-GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC-5′ Exon 19: 5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′ 3′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-5′ Exon 20: 5′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3′ 3′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-5′ Exon 21: 5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′ 3′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-5′

Die Temperatur für Primerhybridisierung lag bei 58 °C. Im nächsten Schritt wurden 2 µl des Reaktionsgemisches unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:

Exon 18: 5′-CAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC-3′

3′-CCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG-5′

Exon 19: 5′-CCTTAGGTGCGGCTCCACAGC-3′

Exon 20: 5′-GAAACTCAAGATCGCATTCATGC-3′ 3′-GCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG-5′

Exon 21: 5′-CAGCCATAAGTCCTCGACGTGG-3′

3′-CATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC-5′

Im Anschluss wurde die aufgereinigte DNA mithilfe des ABI BigDye Terminator Kit v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert und mit ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) genetisch ausgewertet.

Für die Untersuchung von EGFRvIII wurde die zuvor isolierte RNA einer Echtzeit-Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (real-time RT-PCR) unterzogen. Folgende Primer über der Deletion wurden verwand:

3′-GGGCTCTGGAGGAAAAGAAA-5′ 3′-TCCTCCATCTCATAGCTGTCG-5′

Zu diesem Zweck wurden 10 µl RNA mit 10 µl Mastermix, hergestellt entsprechend dem High-capacity archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), für die cDNA-Synthese eingesetzt. Die real-time RT-PCR erfolgte im Bio-Rad Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) nach Herstellerangaben.

4 E

4.1 Demographische Charakteristik der Kohorte

Tabelle 1 gibt einen Überblick über die demographischen Daten der untersuchten Patienten. In Kürze, von den untersuchten 55 Ependymomen wurden 40 als WHO-Grad II und 15 als WHO-WHO-Grad III Ependymome klassifiziert. Das Geschlechter-verhältnis männlich zu weiblich betrug 6:5 in der Gruppe der WHO-Grad II Ependymome und 3:2 unter den WHO-Grad III Ependymomen. Das Patientenalter zum Diagnosezeitpunkt reichte von 2 bis 79 Jahren, der mittlere Wert lag bei 45 Jahren unter den WHO-Grad II und 26 Jahren unter den WHO-Grad III Ependymomen. Von den 40 WHO-Grad II Ependymomen waren 11 (27,5 %) intrakraniellen und 29 (72,5 %) intramedullären Ursprungs. Zwischen den 15 WHO-Grad III Ependymomen wiesen 9 (60,0 %) eine intrakranielle und 6 (40,0 %) eine Lokalisation im Rückenmark auf.

Tabelle 1. Demographische Charakteristik der Stichprobe.

Anzahl der Fälle (%)

WHO Grad II WHO Grad III Durchschnittsalter (st) _{45 (21.0) 26 (17.4)} männlich : weiblich 6 : 5 3 : 2 supratentoriell 0 _{6 (40.0)} infratentoriell _{11 (27.5) 3 (20.0)} zervikal _{12 (30.0) 5 (33.3)} zerviko-thorakal _{5 (12.5) 0} thorakal _{7 (17.5) 0} lumbosakral _{1 (2.5) 1 (6.7)} Tumor Lokalisation Conus-Cauda-Region 4 (10.0) 0

4.2 Kontrolle des TMA mittels Mib-1 und p53

Wie bereits erwähnt, wurden die zu untersuchenden Tumorproben in einem TMA zusammengestellt. Dieses Format erlaubt die simultane immunhistochemische Untersuchung und den direkten Vergleich der Ergebnisse. Da ein kleines Areal repräsentativ für den Tumor ausgewählt wird, sind Fehler bei der Probenauswahl nicht auszuschliessen. Zur Kontrolle eignet sich die Gegenüberstellung der Proliferationsindices des Gewebeschnittes vom Spenderparaffinblock und der daraus entnommenen Gewebestanze auf dem TMA (Tabelle 2). Innerhalb der WHO-Grad II Ependymome auf dem TMA betrug der Mib-1-Proliferationsindex im mittel 1,80 % (Standardabweichung st 4,71) verglichen mit 2,85 % (st 6,45) auf den her-kömmlichen Gewebeschnitten. Unter den WHO-Grad III Ependymomen lag dem Mittelwert von 11,99 % (st 16,68) für die Gewebestanzen der mittlere Mib-1 LI von 25,55 % (st 15,38) für die Gewebeschnitte gegenüber.

Ergänzend haben wir den p53 LI für den TMA ermittelt. Innerhalb der WHO-Grad II Ependymome lag der mittlere Wert bei 9,48 (st 14,15), während er für WHO-Grad III Ependymome 16,06 (st 17,40) betrug.

Tabelle 2. Ergebnisse der Mib-1– und p53-Färbungen.

analysiert Intervall Mittelwert(st)

Mib-1 TMA 55 0 – 63.3 4.58 (11.29) WHO-Grad II 40 0 – 21.2 1.80 (4.71) WHO-Grad III 15 0 – 63.3 11.99 (18.69) Mib-1 Gewebeschnitt 55 0 – 42.0 7.16 (11.36) WHO-Grad II 40 0 – 33.5 2.85 (6.45) WHO-Grad III 15 0 – 42.0 25.55 (15.38) p53 TMA 54 0 – 45.0 11.31 (15.24) WHO-Grad II 39 0 – 44.0 9.48 (14.15) WHO-Grad III 15 0 – 45.0 16.06 (17.40)

4.3 Expression von EGFR

Erhebliche Unterschiede fanden sich in der Anzahl der EGFR-exprimierenden Tumoren abhängig vom eingesetzten Antikörper. Insgesamt konnte in 33/55 (60 %) Tumoren eine EGFR-Expression mit dem Antikörper von Dako nachgewiesen werden, dagegen nur in 16/55 (30 %) Fällen mit dem Antikörper von Zymed. Im Detail wurde eine Überexpression (Score 2+ oder 3+) von EGFR in 23 (57,5 %) Ependymomen WHO-Grad II und 10 (66,7 %) Ependymomen WHO-Grad III mit dem Antikörper von Dako nachgewiesen. Mit dem Antikörper von Zymed war EGFR nachweisbar in 9 (23,1 %) Ependymomen WHO-Grad II und 7 (46,7 %) Ependymomen WHO-Grad III. Hinsichtlich der Tumorlokalisation konnte eine Überexpression von EGFR in 4/11 (36,4 %) intrakraniellen und 19/29 (65,5 %) intramedullären WHO-Grad II sowie in 8/9 (88,9 %) intrakraniellen und 2/6 (33,3 %) intramedullären WHO-Grad III Ependymomen mit dem Antikörper von Dako nachgewiesen werden. Mit dem Antikörper von Zymed zeigten 2/11 (18,2 %) zerebrale und 7/29 (24,1 %) spinale WHO-Grad II Ependymome sowie 5/9 (55,6 %) zerebrale und 2/6 (33,3 %) spinale WHO-Grad III Ependymome eine Überexpression von EGFR.

Die unterschiedlichen Stufen der EGFR-Expression mit Antikörpern von Dako und Zymed zeigt Abbildung 1.

4.4 EGFR-Genstatus-Analyse

FISH konnte erfolgreich durchgeführt werden in 54 Fällen. In 3 (5,5 %) Fällen konnte eine EGFR-Amplifikation nachgewiesen werden, davon war 1 (2,5 %) Ependymom WHO-Grad II und 2 (13,3 %) Ependymome WHO-Grad III. (Tabelle 3) Dabei handelte es sich um zwei spinale und einen zerebralen Tumor. In einem WHO-Grad III Ependymom handelte es sich um eine starke Amplifikation mit mehr als 20 EGFR-Gensignalen pro Zellkern. Ein Zugewinn vom EGFR-Gen wurde beobachtet in 7 (17,5 %) WHO-Grad II und 2 (13,3 %) WHO-Grad III Ependymomen. (Tabelle 3) Eine Chromosom 7-Polysomie, das heisst das Vorhandensein von mehr als 3 Signalen für EGFR und CEP 7 pro Zellkern, konnte in 25 (62,5 %) WHO-Grad II und 7 (46,7 %) WHO-Grad III Ependymomen nachgewiesen werden. (Tabelle 3)

Abbildung 1. Immunohistochemische Färbung und FISH zum EGFR-Nachweis in

Ependymomen. A Repräsentative Fälle von Ependymomen mit unterschiedlichen EGFR-Scores (0 bis 3+) unter Verwendung der Antikörper von Dako und Zymed. Maßstabsbalken entspricht 50 µm. B Repräsentative Fälle mit normalem und aplifiziertem EGFR-Gen, dabei entspricht rotes Signal dem EGFR-Gen und grünes dem Centromer von Chromosom 7.

Tabelle 3. Ergebnisse der Immunohistochemie und FISH. (Zeichenerklärung: n.a. :

nicht analysiert; ex20: Exon 20; wt: Wildtyp) EGFR IHC SCORE FALL

NR.

WHO GRAD

TUMOR

LOKALISATION Zymed Dako EGFR FISH Exon 18-EGFR

21

EGFRvIII

1 II intrakraniell 0 0 3 n.a. n.a.

2 II spinal 0 0 3 n.a. n.a.

3 II intrakraniell 0 2+ Zugewinn n.a. n.a.

4 II spinal 0 0 3 n.a. n.a.

5 II spinal 2+ 2+ Zugewinn n.a. n.a.

6 II spinal 1+ 3+ 4 – 5 silent ex20 n.a.

7 II spinal _{1+ 2+} 3 – 5 n.a. n.a.

8 II spinal 1+ 2+ 4 n.a. n.a.

9 II spinal _{1+ 3+} 3 wt n.a.

10 II intrakraniell 1+ 1+ 2 n.a. n.a.

11 II spinal 0 1+ Zugewinn n.a. n.a.

12 II intrakraniell 3+ 0 2 n.a. n.a.

13 II spinal 0 2+ 3 – 4 n.a. n.a.

14 II spinal 0 2+ 3 n.a. n.a.

15 II intrakraniell 0 0 2 n.a. n.a.

16 II spinal 0 2+ Zugewinn n.a. n.a.

17 II intrakraniell 1+ 3+ 3 silent ex20 n.a.

18 II spinal 0 1+ 4 – 5 n.a. n.a.

19 II spinal _{2+ 3+} 2 wt n.a.

20 II spinal _{1+ 3+} 3 – 4 n.a. n.a.

21 II spinal 1+ 2+ 3 – 4 n.a. n.a.

22 II spinal 3+ 3+ Zugewinn silent ex20 n.a.

23 II spinal 0 2+ 3 n.a. n.a.

24 II spinal 0 0 3 n.a. n.a.

25 II intrakraniell 0 2+ 3 n.a. n.a.

26 II spinal n.a. 0 n.a. n.a. n.a.

27 II intrakraniell 1+ 1+ 2 n.a. n.a.

28 II spinal 2+ 3+ Amplifikation silent ex20 wt

29 II intrakraniell 0 0 2 n.a. n.a.

30 II spinal 0 0 Zugewinn n.a. n.a.

31 II spinal _{1+ 2+} 3 n.a. n.a.

32 II spinal 0 2+ 3 – 4 n.a. n.a.

33 II spinal 0 0 Zugewinn n.a. wt

34 II spinal 3+ 3+ 5 n.a. wt

35 II spinal _{1+ 1+} 3 – 4 n.a. n.a.

36 II spinal _{3+ 3+} 3 – 4 n.a. n.a.

37 II spinal _{1+ 1+} 3 n.a. wt

38 II intrakraniell 0 2+ 3 n.a. n.a.

39 II intrakraniell 3+ 1+ 3 n.a. n.a.

40 II spinal 3+ 3+ 4 wt n.a.

41 III spinal ₁₊ 0 Zugewinn n.a. n.a.

42 III intrakraniell _{1+ 2+} 3 – 4 n.a. n.a.

43 III spinal _{2+ 2+} 3 n.a. n.a.

44 III spinal 0 1+ Amplifikation silent ex20 wt

45 III intrakraniell 1+ 3+ 3 n.a. n.a.

46 III spinal _{1+ 1+} 2 n.a. n.a.

47 III spinal _{3+ 3+} 3 – 4 silent ex20 n.a.

48 III intrakraniell _{3+ 3+} 3 silent ex20 n.a.

49 III intrakraniell 0 1+ 2 n.a. n.a.

50 III intrakraniell 3+ 2+ Zugewinn n.a. n.a.

51 III intrakraniell 3+ 3+ Amplifikation S768I wt

52 III intrakraniell _{1+ 2+} 2 n.a. n.a.

53 III intrakraniell 3+ 3+ 3 – 4 silent ex20 n.a.

54 III spinal 0 0 2 n.a. wt

4.5 Vergleich von immunhistochemischer EGFR-Expression und

FISH

Von den drei Fällen mit amplifiziertem EGFR-Gen zeigten zwei Ependymome eine starke EGFR-Expression unter beiden Antikörpern. Unter den 32 Fällen mit Chromosom-7-Polysomie ohne Amplifikation zeigten 23 (71,9 %) Ependymome eine Überexpression von EGFR mit dem Antikörper von Dako und 7 (21,9 %) mit dem Antikörper von Zymed. Innerhalb der 10 Ependymome, die weder eine Amplifikation noch eine Polysomie aufwiesen, waren 2 (20 %) positiv für EGFR mit beiden Antikörpern.

Die Korrelation zwischen der immunhistochemisch ermittelten EGFR-Expression und dem EGFR-Genstatus ermittelt mit FISH war statistisch nicht signifikant. (Tabelle 4) Es gab ebenfalls keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der EGFR-Expression bzw. dem EGFR-Genstatus und dem WHO-Grad. (Tabelle 4)

Tabelle 4. Korrelation der EGFR-Expression mit dem WHO Grad der Ependymome. EGFR IHC

Zymed Dako

WHO Grad EGFR FISH Anzahl

n Negativ (n) Positiv (n) Negativ (n) Positiv (n)

II normal 31 25 6 13 18 Zugewinn 7 5 2 3 4 Amplifiziert 1 0 1 0 1 III normal 11 6 5 3 8 Zugewinn 2 1 1 1 1 Amplifiziert 2 1 1 1 1 χ2, p= 0.293 0.144 0.915 0.18 0.733

4.6 Nachweis einer EGFR-Mutation

Wir sequenzierten die Exons 18-21 des EGFR-Gens in denjenigen Tumoren, die eine Amplifikation oder eine eindeutige Überexpression von EGFR aufwiesen (n=13). Davon fand sich bei einem Tumor mit stark amplifiziertem EGFR und kräftiger EGFR-Expression mit Antikörpern von Dako und Zymed eine Punktmutation in Exon 20 (Codon 768, AGC→ATC, Ser→Ile). (Paez et al. 2004) Bei dem Patienten handelte es sich um eine zum Diagnosezeitpunkt 61-jährige Frau mit einem supratentoriellen, anaplastischen (WHO-Grad III) Ependymom. (Abbildung 2)

Ferner wurde im Exon 20 eine silent mutation (Codon 787, CAG→CAA, Gln→Gln) in 8 (61,5 %) Fällen beobachtet.

Unter 8 repräsentativ ausgewählten Ependymomen, darunter auch diejenigen mit amplifiziertem EGFR-Gen, wurde nach der Mutation EGFRvIII gefahndet, die in keinem dieser Ependymome nachgewiesen werden konnte.

Abbildung 2. Morphologie des anaplastischen Ependymoms mit EGFR S768I

Mutation. Zu sehen sind repräsentative Ausschnitte mit A HE; B GFAP; C Mib-1; D EGFR-Expression mit dem Antikörper von Dako und E Zymed; F FISH. Die Tumorzellen sind hoch polymorph, jedoch sind die architektonischen und immunhistologischen Charakteristika eines Ependymoms erhalten. EGFR ist stark exprimiert (D, E) und amplifiziert (F). Maßstabsbalken beträgt 50 µm.

5 D

Die Liganden-gesteuerte Aktivierung von EGFR, eines transmembranen Tyrosinkinase-Rezeptors, setzt Signalkaskaden in Gang, welche das Zellwachstum stimulieren und die Zellmotilität steigern. (Kari et al. 2003) EGFR ist überexprimiert, mutiert oder amplifiziert in einer Vielzahl von Neoplasien. (Ciardiello et al. 2008) Für Kolon- und Lungenkarzinome ist der EGFR-Status ein guter Parameter für die Prognose und für das Ansprechen einer gezielten anti-EGFR-Therapie. (Janku et al. 2010) Für eine Subgruppe von Gliomen, nämlich für gewisse Glioblastome, kommt EGFR eine wichtige Rolle für die Vorhersage des klinischen Verlaufs zu, doch haben klinische Studien zur Untersuchung einer EGFR-gezielten Therapie enttäuschende Ergebnisse zutage gebracht. (Huang et al. 2009, Felsberg et al. 2009, Thaker et al. 2009)

Der Signalweg spielt eine Rolle bei Ependymomen und EGFR-Überexpression wurde als unabhängiger prognostischer Faktor für ihre maligne Entwicklung identifiziert. (Yi et al. 2009, Mendrzyk et al. 2006) Tatsächlich ist die EGFR-Überexpression der einzige signifikante Vorhersageparameter für eine schlechte Prognose bei Patienten mit intrakraniellen WHO-Grad II Ependymomen und liefert damit wertvolle Information für Risikoeinschätzung und Behandlung. (Massimino et al. 2009, Senetta et al. 2011)

In der vorliegenden Studie verglichen wir die immunhistochemisch gemessene Proteinexpression mit dem Genstatus. Wir stellten eine EGFR-Überexpression bei der Mehrzahl der Tumoren fest, dennoch fanden wir nur gelegentlich eine EGFR-Genamplifikation. Von 33 Ependymomen mit stark exprimiertem EGFR unter Einsatz des Antikörpers von Dako zeigten 16 eine starke EGFR-Expression mit dem Antikörper von Zymed und nur 2 eine Amplifikation. Zusätzlich beobachteten wir eine EGFR-Amplifikation in einem Tumor ohne markante EGFR-Expression in der Immunhistochemie. Wir konnten nicht den Nachweis von EGFRvIII in ausgewählten Tumoren erbringen, welches häufig in Glioblastomen vorzufinden ist. (Jeuken et al. 2009) Unsere Ergebnisse bezüglich der EGFR-Amplifikation stehen im Einklang mit einer vorangehenden Studie, die einen Zugewinn von 7p11.2, einer EGFR-enthaltenden genomischen Region, in einer Teilmenge von Ependymomen beobachtet hat. (Mendrzyk et al. 2006) Jedoch

einer CISH unterzog und keine EGFR-Amplifikation festgestellt hat. (Marquez et al. 2004) Die Diskrepanz zwischen EGFR-Genamplifikation und EGFR-Expression in Ependymomen ist unerwartet, als sowohl balancierte Polysomie wie auch EGFR-Amplifikation mit der immunhistochemisch ermittelten EGFR-Expression in anderen Gliomen wie Astrozytomen zu korrelieren scheinen. (Marquez et al. 2004, Libermann et al. 1985, Schober et al. 1995) Weil der Zusammenhang zwischen der EGFR-Genamplifikation und EGFR-Expression uneinheitlich in anderen Neoplasien zu sein scheint, insbesondere bei Plattenepithelkarzinomen, Kopf-Hals-Tumoren und hepatozellulären Karzinomen als nicht korrelierend, jedoch eine gute Korrelation für Adenokarzinome der Lunge beschrieben worden ist, könnten zellspezifische Mechanismen dafür verantwortlich sein. (Buckley et al. 2008, Kearsley et al. 1991, Li et al. 2008) In Fällen mit immunhistochemisch ermittelt starker EGFR-Expression bei Abwesenheit von EGFR-Amplifikation oder Zugewinn wären andere ursächliche Mechanismen wie erhöhtes Ligandenangebot, rezeptoraktivierende Mutationen oder Heterodimerisation mit anderen transmembranen Tyrosinkinasen wie HER2 denkbar. (Buckley et al. 2008)

Da wir ein gehäuftes Vorkommen von EGFR-Überexpression und das Vorhandensein von EGFR-Amplifikation in unserer Stichprobe beobachtet haben, würde man in EGFR – analog zu Astrozytomen – eine wichtige Rolle in der Tumorprogression der Ependymome vermuten. Wir vermuten ein vermehrtes Auftreten von EGFR-Genamplifikationen unter Ependymomen WHO-Grad III (13,3 %) im Vergleich zu WHO Grad II (2,5 %), jedoch erreichte diese Korrelation keine statistische Signifikanz. Die Korrelation zwischen immunhistochemisch nachgewiesener EGFR-Expression und dem WHO-Grad ist schwach und vom verwendeten Antikörper abhängig. Das deutet darauf hin, dass die Analyse der EGFR-Genkopien mittels FISH oder die Kombination aus FISH und Immunhistologie mehr klinisch relevante Ergebnisse einbringen als die Immunhistochemie allein. Die Diskrepanz zwischen den Antikörpern von Dako und Zymed ist beschrieben worden. (Buckley et al. 2007) Im Gegensatz zur Studie von Buckley et al., wo mehr positive Ergebnisse mit dem Antikörper von Zymed ermittelt worden sind, befindet unsere Datenlage den Antikörper von Dako sensitiver im Vergleich zu Zymed.

Mutationen im EGFR-Gen sind bei Glioblastomen beschrieben worden, die häufigste unter ihnen ist EGFRvIII. (Fukushima et al. 2006) Bisher wurden keine EGFR-Mutationen bei Ependymomen beobachtet. Wir analysierten sowohl die

Tyrosinkinase-Domäne des EGFR als auch das Vorhandensein von EGFRvIII und berichten zum ersten Mal von einer Missense-Mutation in Exon 20 (Codon 768, AGC→ATC, Ser→Ile) des EGFR-Gens in einem anaplastischen Ependymom. Fukushima et al. konnten die identische Mutation in einem primären Glioblastom nachweisen. Im Gegensatz zu unserem Patienten, bei dem zusätzlich eine EGFR-Amplifikation vorlag, wurde dies nicht von Fukushima et al. untersucht. (Fukushima et al. 2006) Es wäre interessant herauszufinden, ob die Genamplifikation der Mutation vorausgeht, wie es im Falle von EGFRvIII bei Glioblastomen angenommen wird. (Frederick et al. 2000)

Alle In-situ-Analysen führten wir auf einem TMA aus. Unser Gewebearray bestand aus zwei repräsentativen Gewebestanzen von jedem Tumor. Wie bereits publiziert, fanden wir eine gute Konkordanz zwischen großen histologischen Schnitten und dem TMA, wie aus der deutlichen Diskriminierung der Wachstumsfraktion zwischen WHO-Grad II und WHO-WHO-Grad III Ependymomen auf großen Gewebeschnitten verglichen mit den Gewebestanzen hervorging. (Simon et al. 2003)

Abschliessend konnten wir die Wichtigkeit des EGF-Rezeptors in Ependymomen untermauern, indem wir gezeigt haben, dass 1) EGFR in der Mehrzahl der Ependymome überexprimiert wird, 2) eine EGFR-Genamplifikation bei Ependymomen vorliegen kann, und 3) mutiertes EGFR einer Entstehung von Ependymomen zugrunde liegen kann. Wir fanden keine Korrelation zwischen amplifiziertem EGFR-Gen und exprimiertem EGFR. Weitere Untersuchungen sind nötig, um klinische und molekulare Einzelheiten in der Rolle von EGFR und Pathophysiologie der Ependymome aufzuklären.

6 Z

Die Pathogenese von Ependymomen und prognostische Faktoren sind unzureichend verstanden. Es konnte gezeigt werden, dass dem EGF-Rezeptor eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Gliomen zukommt.

In vorliegender Studie untersuchten wir die immunhistologische Expression und Genstatus mittels FISH von EGFR, die Wachstumsfraktion entsprechend Mib-1 und die Expression von p53 in 40 WHO-Grad II und 15 WHO-Grad III Ependymomen. Alle Tumorproben wurden in ein TMA-Format überführt, das EGFR-Gen wurde sequenziert und die Ergebnisse miteinander verglichen.

Wir fanden ein immunhistochemisch überexprimiertes EGFR in 30-60 % der Tumoren, in Abhängigkeit vom verwendeten Antikörper. Das EGFR-Gen war amplifiziert in 5,5 % der Ependymome. Ausserdem fanden wir eine Missense-Mutation in Exon 20 (S768I) in der Tyrosinkinase-Domäne des EGFR-Gens. Die EGFR-Expression korrelierte nicht mit der Amplifikation.

Daraus folgern wir, dass die immunhistochemisch ermittelte EGFR-Expression häufig bei Ependymomen auftritt. Es gibt einen schwachen Zusammenhang zwischen amplifiziertem EGFR und seiner Expression. EGFR-Mutationen können in ausgewählten Ependymomen vorhanden sein.

7 A

CA California

cDNA Copy-DNA

CEP centromere enumeration probe

CISH chromogenic in-situ hybridization

DAB 3.3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid

DAPI 4′,6-Diamino-2-Phenylindol

DNA Desoxyribonukleinsäure

EGFR epidermal growth factor receptor

EMA epitheliales Membranantigen

FISH Floureszenz-in-situ-Hybridisierung

Glu Glutaminsäure

HE Hämatoxylin-Eosin

HER2 human epidermal growth factor receptor

HRP horseredish peroxidase Ig Immunglobulin IL Illinois Ile Isoleucin kb Kilobasen LI labeling index

MAP-Kinase mitogen-aktivierte Proteinkinase

Mb Megabasen

mM millimolar

mRNA Messenger-RNA

MYC avian myelocytomatosis virus

NF2 Neurofibromatose Typ 2

PCR plymerase chain reaction

PKD proteinase K digest

pH pondus hydrogenii (negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration)

Raf rat fibrosarcoma

RT-PCR reverse transcriptase PCR

Ser Serin

st Standardabweichung

TBS Tris-buffered saline

TMA tissue microarray

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

8 L

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An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die diese Arbeit ermöglicht und zu ihrem Gelingen maßgeblich beigetragen haben.

Mein ganz besonderer Dank gilt dem Direktor des Instituts für Neuropathologie und meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. Markus Glatzel, der mir die Gelegenheit zu dieser Arbeit erst gegeben hat. Ich danke ihm insbesondere für die sehr gute fachkundige und persönliche Betreuung, mit der ich stets sehr zufrieden war. Er hat den Schaffungsprozess mit hilfreichen Ratschlägen, Anregungen und viel Enthusiasmus begleitet.

Weiterhin danke ich den Herren Dr. med. Christian Bernreuther und Dr. med. Jakob Matschke für die hilfreiche Unterstützung beim Mikroskopieren und bei der Literaturrecherche. Ich bedanke mich für die kompetente Unterstützung bei komplizierten Fragestellungen.

Martin Haberkorn und seinem Laborteam der Neuropathologie danke ich für die technische Mithilfe bei der Anfertigung von histologischen Gewebeschnitten und immunhistochemischen Färbungen. Herrn S. Eghtessadi danke ich für die Hilfe bei der FISH und Frau A. Blaszczyk-Wewer für die Unterstützung bei der Sequenzierung.

Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich während des Studiums stets nicht nur finanziell, sondern auch emotional, unterstützt haben.

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V

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe.

Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe.