7.5.1 Darstellung der Wachstumskurven an Mammakarzinomzellen
Im Zusammenhang mit Autoperoxidation durch Laserbestrahlung von Perylen-diimid-dotierten Liposomen wurde ebenfalls, analog zu Abschnitt 7.3 der wachstumshemmende Effekt an kultivierten Mammakarzinomzellen (MDA-MB 231) untersucht. Dazu wurden die Stammlösungen der Liposomen sowohl mit der Ultraschallbad-Methode als auch durch Extrusion hergestellt (vgl. Abschnitt 6.2.1 und 6.2.2). Die Farbstoffkonzentration der Liposomen hergestellt mit der Ultraschallbadmethode betrug dabei 4·10-5 mol/l, die Farbstoffkonzentration der Liposomen hergestellt mit der Extrusionstechnik wurde durch das zusätzliche Abzentrifugieren des überschüssigen Farbstoffes um das etwa 44-fache reduziert, sodass man von einer 9⋅10−7molaren Stammlösung ausgehen kann. Die Bestrahlung der Farbstoff-dotierten Liposomen erfolgte bei 13°C bei einer Laserleistungsdichte von etwa 140 mW/cm2 und ergab einen Reduktionsfaktor von RF(38min)=64% bei einem Volumen der Probe von 4 ml. Um die Stärke des Effekts bestimmen zu können, wurde die Liposomensuspension (Stammlösung) vor Applikation an den Tumorzellen mit 1:10 bzw.
1:30 in Kulturmedium verdünnt. Somit betragen die Farbstoffkonzentration der Liposomensuspensionen (hergestellt durch Extrusionstechnik), die an den Tumorzellen appliziert wurden, 9⋅10−8mol/l bzw. 3⋅10−8mol/l. Prinzipiell wird jedoch davon ausgegangen, dass durch die beiden Liposomenpräparationen (Extrusionstechnik und Ultraschallbadmethode) anteilsmäßig gleich viel gelöster Farbstoff in die Lipidmembran der Liposomen eingebaut wird, da durch den Beschallungsvorgang im Ultraschallbad (vgl.
Abschnitt 6.2) bei beiden Präparationstechniken gleich viel Lipidanteil in den Liposomensuspensionen vorliegt und somit von einer äquivalenten Aufnahmewahrscheinlichkeit des Farbstoffes in die Lipidmembran ausgegangen werden kann. Ebenso wird dann nach der laserinduzierten Synthese der Endoperoxide in Liposomen bei beiden Liposomenpräparationsmethoden im Falle eines gleichen Reduktionsfaktors von einer gleichen Wirksubstanz in der Stammlösung ausgegangen.
In Abbildung 7.9 werden die Wachstumskurven der Mammakarzinomzellen in Abhängigkeit von der Inkubationszeit (180 h) dargestellt. Der in den Wachstumskurven gegen die
a) zeigt die zytostatische Wirkung der laserbestrahlten Farbstoff-dotierten Liposomen (Herstellung: Extrusions-Technik) bei den Verdünnungen 1:10 bzw. 1:30 in Kulturmedium verglichen mit der Kontrolle PBS. Man kann bei der Verdünnung 1:10 erkennen, dass die zytostatische Wirkung nach bereits 120 Stunden eintritt, während sie bei der Verdünnung 1:30 nach etwa 160 Stunden eintritt. Vergleicht man die Wachstumskurven mit b), so kann man bei den laserbestrahlten Farbstoff-dotierten Lioposomen, die im Ultraschallbad hergestellt wurden, bei der 1:30 Verdünnung nahezu keinen zytotoxischen Effekt feststellen, obwohl die Ausgangszelldichte um einen Faktor zwei (siehe Absorptionsindex zu Beginn der Inkubation) erniedrigt ist. c) bzw. d) zeigt das Zellwachstum bei Applikation der Farbstoff-dotierten bzw.
undotierten Liposomen (Herstellung: Extrusions-Technik) in den Verdünnungen 1:10 und 1:30. Man kann erkennen, dass sowohl die undotierten als auch die Farbstoff-dotierten Liposomen bei der Verdünnung 1:30 keinen Effekt an Tumorzellen zeigen (nahezu identischer Wachstumsverlauf mit der Kontrolle), während sie bei der Verdünnung 1:10 bereits leicht zytotoxisch sind. Untersuchungen mit dem Konfokalmikroskop haben gezeigt, dass die Liposomen bei den Verdünnungen 1:10 bereits Aggregate bilden, die an sich selbst schon zytotoxisch sind. Aus diesem Grund wurde für die Untersuchungen an Tumorzellen die auch pharmazeutisch übliche Verdünnung von 1:30 gewählt (vgl. Abschnitt 7.3).
Abbildung 7.10 beschreibt die Kontrolle an Tumorzellen mit dem Zytostatikum Cisplatin mit einer Konzentration von 1·10-6 mol/l bzw. 5·10-6 mol/l. Cisplatin ist in diesem Zellversuch somit über eine Größenordnung höher konzentriert als die applizierten Liposomensuspensionen hergestellt durch Extrusion-Technik. Aus den Abbildungen kann man entnehmen, dass die laserbestrahlten, Farbstoff-dotierten Liposomensuspensionen hergestellt durch Extrusion-Technik bei einer Endkonzentration von 3·10-8 mol/l den gleichen Effekt an Tumorzellen zeigen, als das Zytostatikum Cisplatin in der Konzentration von 5·10-6 mol/l.
Abbildung 7.9: Wachstumskurven von Mammakarzinomzellen nach Applikation von laserbestrahlten Perylen-Diimid dotierten Liposomen bei T=37°C. a) zeigt die zytostatische Wirkung der laserbestrahlten Farbstoff-dotierten Liposomen (Herstellung: Extrusions-Technik) bei den Verdünnungen 1:10 bzw. 1:30 in Kulturmedium verglichen mit der Kontrolle PBS. Man kann bei der Verdünnung 1:10 erkennen, dass die zytostatische Wirkung nach bereits 120 Stunden eintritt, während sie bei der Verdünnung 1:30 nach etwa 160 Stunden eintritt. Vergleicht man die Wachstumskurven mit b), so kann man bei den laserbestrahlten Farbstoff-dotierten Lioposomen im Ultraschallbad hergestellt, bei der 1:30 Verdünnung nahezu keinen zytotoxischen Effekt feststellen, obwohl die Ausgangszelldichte um einen Faktor zwei (siehe Absorptionsindex zu Beginn der Inkubation) erniedrigt ist. c) bzw. d) zeigt das Zellwachstum bei Applikation der Farbstoff-dotierten bzw. undotierten Liposomen (Herstellung: Extrusions-Technik) in den Verdünnungen 1:10 und 1:30. Man kann erkennen, dass sowohl die undotierten, als auch die Farbstoff-dotierten Liposomen, bei der Verdünnung
Abbildung 7.10: Wachstumskurven von Mammakarzinomzellen nach Applikation des Zytostatikums Cisplatin. Der Graph zeigt analog zur Abbildung 7.9 die zeitliche Entwicklung der Zellpopulation bei Applikation von Cisplatin mit den Konzentrationen 1·10-6 mol/l bzw.
5·10-6 mol/l. Zu bemerken ist, dass bei einer Konzentration von 1·10-6 mol/l ein nur sehr geringer zytotoxischer Effekt beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu kann bei den Liposomensuspensionen hergestellt durch Extrusion-Technik in der Verdünnung 1:30 und schließlich einer Endkonzentration von 3·10-8 mol/l nach etwa 160 Stunden eine zytostatische Wirkung beobachtet werden wie bei Cisplatin in der Konzentration 5·10-6 mol/l (siehe Abbildung 7.9 a).
7.5.2 Darstellung der Wachstumskurven an Kolonkarzinomzellen
Neben Mammakarzinomzellen der Zelllinie MDA-MB 231 wurden auch Kolonkarzinomzellen der Zelllinie HT29 auf die zytostatische Wirkung der laserbestrahlten Perylendiimid-dotierten Liposomen überprüft. Dabei wurden wiederum Liposomen, hergestellt durch Extrusion-Technik, an den Tumorzellen appliziert. Die Farbstoffdotierung der Stammlösung betrug wiederum 9·10-7 mol/l und wurde vor Applikation 1:30 verdünnt.
Der Reduktionsfaktor konnte nach der Laserbestrahlung zu 60% ermittelt werden. Abbildung 7.11 zeigt das Wachstumsverhalten der Kolonkarzinomzellen nach Applikation der Liposomensuspensionen in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Hervorzuheben ist dabei, dass die laserbestrahlten Farbstoff-dotierten Liposomen nach der Inkubationszeit von etwa 200 Stunden einen zytociden Effekt zeigen da die Zelldichte zum Ende geringer ist als zu Beginn des Zellversuches (vgl. Abschnitt 6.3.3).
Abbildung 7.11: Demonstration des zytociden Effektes an Kolonkarzinomzellen der Zelllinie HT-29 von laserbestrahlten Farbstoff-dotierten Liposomen in der Verdünnung 1:30 innerhalb der Inkubationszeit von 200 Stunden a). Zur Kontrolle wurde an den Tumorzellen zeitgleich PBS dazugegeben. b) bzw. c) zeigen den Wachstumsverlauf der Tumorzellen bei Applikation von Farbstoff-dotierten bzw. undotierten Liposomen. In d) kann man erkennen, dass das Zytostatikum Cisplatin in der Konzentration von 1·10-6 mol/l kaum eine toxische Wirkung auf den Wachstumsverlauf der Zellen hat. Hier wurde zur Kontrolle