Zweiter SPIM-Aufbau

Der zusätzliche Aufbau gleicht dem oben beschrieben in der grundlegenden Konzeptionierung.

Der gröÿte Unterschied zum vorherigen Aufbau ist eine horizontale Ausrichtung der optischen

4 SPIM-AUFBAU

Abb. 4.4: Skizze des zweiten SPIM-Aufbaus

Die Strahlen werden am Strahlteiler (BS) aufgeteilt und über zwei Spiegel auf einen Telesko-paufbau aus zwei LinsenL_5,6 gelenkt. Nachdem die Strahlen dort aufgeweitet wurden passieren diese eine verstellbare Irisblende und treen auf eine ZylinderlinseF_Zyl, die zu einer Fokussie-rung inz führt. Das Anregungsobjektiv formt so mit der Zylinderlinse das statische Lichtblatt in der Fokusposition. Durch Variation der Irisblende kann der Strahldurchmesser auf der hin-teren Apertur des Objektivs und damit auch die Lichtblattdicke verändert werden. Anregungs-und Detektionsobjektiv benden sich in orthogonaler Ausrichtung in der üssigkeitsgefüllten Probenkammer. Die Probe selbst wird von oben in die Probenkammer eingeführt und über den motorisierten Probenhalter verschoben. Das vom Detektionsobjektiv gesammelte Fluoreszenz-signal wird über einen FilterF von Anregungsstreulicht gereinigt und über eine Tubuslinse auf den Kamerasensor abgebildet.

Achsen des Anregungs- und Detektionsobjektiv zum Probentisch. Dies erlaubt eine Probenprä-paration von oben, das heiÿt, dass insbesondere üssige Proben als kleine Probensäckchen präpariert und von oben in den Fokus bzw. das Lichtblatt geführt werden können [107]. Das erforderte die Konzeptionierung einer Probenkammer, in der die beiden Immersionsobjektive eingeführt werden können, ohne dass die Flüssigkeit in der Kammer austritt. Die hier gewählte

Objektivausrichtung ist somit vergleichbar zu den meisten üblicherweise verwendeten Licht-blattmikroskopen [69]. Eine Skizze dieses Aufbaus ist in Abb. 4.4 zu sehen. Eine Liste der verwendeten Komponenten sowie ein Bild des Aufbaus bendet sich im Anhang dieser Arbeit in Tab. 13 und Abb. D.2. Die Justage des Aufbaus ist vergleichbar mit der bereits für den oben beschriebenen Aufbau erläuterten Prozedur.

Anregungsstrahlengang

Zur Anregung bzw. Lichtblattformung werden Teile der beiden Laserlinien des zuvor beschrie-benen Aufbaus durch einen Strahlteiler BSW10 (Thorlabs) ausgekoppelt. Die Strahlen werden über zwei Spiegel auf die optische Achse einer Schiene gelenkt, auf der ein Teleskopaufbau aus zwei LinsenL5,6 (AC254-xxx-A mit unterschiedlichen Brennweiten, Thorlabs) die Strahlen auf-weitet und kollimiert. Die Strahlen werden damit insgesamt um den FaktorM = ^f_f^6f2

5f1 bezüglich ihrer ursprünglichen Strahldurchmesser vergröÿert. Eine verstellbare Irisblende (IB-D54, Owis) dient zur zusätzlichen Variation des Strahldurchmessers und damit auch der Lichtblattdicke.

Über eine Zylinderlinse (LLJ1629L1-A, Thorlabs) wird der Strahl inz (senkrecht zur Tischebe-ne) auf die BFP des Anregungsobjektivs HCX APO L 10x/0.30 W U-V-I (Leica Microsystems) fokussiert. Dadurch entsteht ein statisches Lichtblatt in der z-y-Ebene. Die Position des Ob-jektivs entlang der optischen Achse lässt sich über einen Linearverschiebetisch justieren.

Probenkammer, Probenpositionierung und Durchlichtquelle

Die Probenkammer besteht aus durchsichtigem Kunststo auf einer Aluminiumplatte und ver-fügt über zwei Önungen an den Seiten für die verwendeten Immersionsobjektive. Diese werden über Dichtungsringe abgedichtet, um ein Austreten der Flüÿigkeit zu verhindern, während eine Nachjustage der Objektive möglich bleibt. Der Probenpositionierer besteht aus einem xyz -Setup aus drei motorisierten Linearverschiebetischen (MTS50/M-Z8, Thorlabs). Am letzten Verschiebetisch ist ein Eigenbau-Probenhalter angebracht, in dem sich unter anderem Greifer und dünne Kanülen zur Probenanbringung montieren lassen. Über eine LED-Lampe (JANSJÖ Arbeitsleuchte, INGKA Holding B.V., Leiden, Niederlande) können Durchlichtaufnahmen der Probe erstellt werden. Eine Verschiebung inxermöglicht die Erstellung von Stack-Aufnahmen der Proben.

Detektionsstrahlengang und Kamerasensor

Ein zweites Objektiv HCX APO L 40x/0.80 W U-V-I (Leica Microsystems) dient zur Detek-tion der angeregten Fluoreszenz in der Probe. Dieses lässt sich wiederum entlang seiner opti-schen Achse über einen Linearverschiebetisch justieren, um die fokale Ebene des Objektivs mit dem Lichtblatt in Deckung zu bringen. Ein Detektionslter F (FF01-531/46-25 oder BLP02-561R-25, Semrock) dient zum Blocken von gestreutem Anregungslicht während eine Tubuslinse (AC508-200-A, Thorlabs) das so bereinigte Signal auf den Kamerasensor einer CCD-Kamera (DFC 360 FX, Leica Microssystems) abbildet.

Kontrollsoftware, Datenverarbeitung und -evaluation

Zur Ansteuerung des Messaufbaus wird ein CELSIUS W520 der Firma Fujitsu K.K. (Tokio, Japan) mit 16 GB Arbeitsspeicher, einen Intel® Xeon® Processor E3-1220V2 @ 3.10 GHz -Prozessor und einem Windows 7 Professional 64-bit -Betriebssystem verwendet. Die Ansteue-rung der Komponenten erfolgt für die Anregungslaser, wie weiter oben beschrieben, über Lab-VIEW. Die Probenpositionierer MTS50/M-Z8, sowie die Kamera DFC 360 FX werden gemein-sam über die Open-Source Softwareumgebung µ-Manager [143] oder bei getrennter Verwen-dung durch die Software LAS AF 2.7 (Leica Microsystems) und µ-Manager angesteuert. Die Kontroll-Software umfasst folgende Parameter und Aufnahmemodi:

4 SPIM-AUFBAU

ˆ Laserleistung der beiden Anregungslaser

ˆ Motor-Position bzw. Verfahrbereich, Schrittweite und -anzahl für eine Stack-Aufnahme

ˆ Parameter zur Langzeitaufnahme von 3D-Stacks (Stackanzahl, Zeitabstand)

ˆ Kameraparameter (Belichtungszeit, Binning, Bit-Tiefe, ROI-Auswahl, Clockrate) Projektbeschreibung des Aufbaus

Der Aufbau wurde vorrangig entwickelt, um Messungen an üssigen Proben (z.B. Beads in wässriger Lösung) mit unterschiedlichen Lichtblattdicken aufzunehmen und nach der DDM-Methode auszuwerten. Die Probenpräparation von oben ermöglicht hier andere Herangehens-weisen im Vergleich zum zuvor beschrieben Versuchsaufbau. Durch die modulare Aufbauweise können zudem unkompliziert Teile ausgetauscht werden und so unterschiedliche Messungen an einem breiten Probenspektrum durchgeführt werden. Zudem ist eine Erweiterung des Detekti-onsarmes für die Durchführung gleichzeitiger Doppelkanalmessungen auf einem Kamerasensor geplant [144]. Zum Zeitpunkt der Abgabe dieser Arbeit sind bereits alle notwendigen Opti-ken hierfür eingetroen. Hierbei wird das detektierte Signal wellenlängenabhängig von einem Dichroiten aufgespalten und auf zwei unterschiedliche Bereiche des Kamerasensor abgebildet (siehe Abb. 4.5). Hierdurch können zeitgleich mehrere Fluorophore angeregt und detektiert wer-den. Zudem sind so auch Kreuzkorrelationsmessungen zwischen unterschiedlichen Wellenlängen nach der SPIM-FCCS-Technik möglich [102, 107].

Abb. 4.5: Detektionspfad für Doppelkanalmessungen

Das detektierte Signal wird zunächst über einen Teleskopaufbau aus zwei Sammellinsen L_7,8 auf eine Maske fokussiert, um den Bildauschnitt aus der Probenebene zu limitieren. Ein Dichroit (DC) trennt den Strahl in zwei Wellenlängenbereiche auf. Über weitere Detektionslter F1,2

werden die Strahlen selektiert. Die beiden Detektionsstrahlengänge werden nun gemeinsam unter einem Winkel auf die Tubuslinse gelenkt, so dass die entsprechenden Wellenlängen auf zwei räumlich getrennten Bereichen des Kameradetektors aufgenommen werden.

Eine weitere Charakterisierung dieses Aufbaus ist Bestandteil der Bachelorarbeit von Herrn Lukas Weihmayer [137] und wird daher an dieser Stelle nicht weiter vorgenommen.