Zusammenfassung

Die viröse Wurzelbärtigkeit (Rizomania) ist derzeit und wird voraussichtlich auch für die Zukunft eine der bedeutendsten Pflanzenkrankheiten im weltweiten Zuckerrübenanbau bleiben. Das beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), welches durch den bodenbürtigen, biotrophen Plasmodiophoromyceten Polymyxa betae übertragen wird, verursacht die Ausbildung eines Wurzelbartes, der zu hohen Ertrags- und Zuckerverlusten führt. BNYVV aus dem Genus Benyvirus ist ein einzelsträngiges sinnpositives RNA Virus, das in Abhängigkeit seiner Herkunft aus 4-5 stäbchenförmigen Viruspartikeln besteht. Die Krankheit wird zurzeit nur über den Anbau von teilresistenten Genotypen mit monogenen, dominant vererbten Resistenzen (Rz1, Rz2, Rz3), die auf Chromosom 3 des Zuckerrübengenoms lokalisiert sind, kontrolliert. Diese reduzieren die Virusreplikation in infizierten Haarwurzeln und verhindern die Ausbreitung des Virus in die Hauptwurzel. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde dazu ein Überblick über bekannte Resistenzen in Zuckerrübe, das Schadbild von Rizomania, sowie die Biologie des Erregers gegeben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten unter Nutzung molekularer Testsysteme pflanzliche Genprodukte aus resistenten Zuckerrüben-Genotypen, die mit dem Pathogenitätsfaktor P25 des BNYVV interagieren, isoliert und anschließend funktionell charakterisiert werden, um Hinweise auf pflanzliche Resistenzfaktoren bzw. Zielproteine der Viruspathogenität zu erlangen.

Das von der BNYVV RNA3 kodierte Genprodukt P25 ist für die Translokation des Virus im Wurzelsystem, die Ertragsbeeinflussung und die Symptomausprägung in anfälligen Genotypen verantwortlich. Die der Wirt-Pathogen Interaktion zugrunde liegenden Funktionen des Pathogenitätsfaktors P25 sind bisher unbekannt. Sicher ist, dass P25 eine „Shuttle“-Funktion besitzt, durch die es dem Protein in infizierten Zellen möglich ist, sich zwischen Zellkern und Cytoplasma transportiert zu werden.

Zur Identifizierung von Proteinen der Zuckerrübe, die an der möglichen Interaktion mit P25 beteiligt sind, wurde ein LexA-basiertes „Yeast Two-Hybrid“ (YTH) System als Protein-Protein Interaktionsassay gewählt. Dieser besteht aus zwei voneinander unabhängigen Transkriptionsfaktoren LexA und B42, die mittels Proteininteraktion als Fusionskomplex die Interaktionsbestätigende Hefetranskription aktiviert.

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Eine aus Wurzel- und Blatt-Gesamt-RNA erstellte cDNA-Bibliothek eines Rz2-resistenten Zuckerrübengenotyps wurde auf Proteininteraktionen mit P25 durchmustert. Nach Durchführung des YTH Screens wurden 450 Kandidaten auf Transkriptionsautoaktivierung und P25 Interaktion überprüft und falsch-positive Reaktionen ausgeschlossen. Abschließend verblieben 36 Kandidatengene, deren Nukleotidsequenzen mittels Datenbanksuche auf Homologie zu Sequenzen mit bekannten Funktionen analysiert wurden. Die Aminosäuresequenzen wurden mit Hilfe einer Datenbank für die Identifizierung von Proteindomänen auf konservierte funktionelle Domänen analysiert. Siebenundzwanzig der 36 Kandidaten wiesen signifikante Homologie zu Sequenzen mit bekannter bzw. putativer Funktion auf und ermöglichten eine Einteilung der Kandidatengene in funktionelle Kategorien.

Dabei waren jene Kandidaten, die eine mögliche funktionelle Beteiligung an der pflanzlichen Erkennung des viralen Pathogenitätsfaktors P25, der Ubiquitinierung, dem Phytohormonstoffwechsel oder dem Zellwand- und Zytoskellettaufbau haben von besonderem Interesse. Um sicherzustellen, dass die nachgewiesenen Interaktionen des YTH Screen keine falsch-positiven waren, wurden diese P25 Interaktionen mittels eines in planta „bimolecular fluorescence complementation assay“ (BiFC) überprüft. Als Resultat des BiFC konnte die Interaktion von zehn Kandidaten bestätigt werden. Die Ergebnisse des YTH Screens und der BiFC Studie sind im dritten Teil beschrieben.

Im vierten Teil der Arbeit erfolgte die detaillierte Charakterisierung eines vielversprechenden, im cDNA-Bibliothekscreen identifizierten Kandidaten. Dieser wurde aufgrund des Auftretens einer nekrotischen Blattreaktion im Rahmen der BiFC Analyse ausgewählt. In der Datenbankanalyse wies der Kandidat eine signifikante Homologie zu einem „kelch repeat-containing F-box“ Protein aus A.

thaliana auf. Eine Beteiligung dieses, zu einer Genfamilie gehörenden Kandidatengens, an der Resistenzreaktion ist denkbar, da pflanzliche F-box Proteine an der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und der Induktion der Resistenzreaktion beteiligt sind. Diese selektierten und mit Ubiquitin markierten Proteine werden dem 26S Proteasom zur Degradation zugeführt. Die vollständige kodierende Sequenz des F-box Kandidaten wurde aus zwei resistenten und einer anfälligen Zuckerrübenlinie isoliert. Anhand von Sequenzvergleichen konnten Polymorphismen gezeigt werden. Dabei wurden keine Unterschiede in den

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bekannten Proteindomänen zwischen den Kandidaten identifiziert, des weiteren konnte die Proteinexpression unter induzierten konstitutiven Bedingungen für den anfälligen als auch die resistenten Kandidaten nachgewiesen werden. Die F-box Kandidaten haben eine Interaktion mit P25 im YTH gezeigt, sowie eine Hypersensitive Reaktion (HR) in Tabak ohne Unterschied zwischen anfälligem und resistentem Ursprung für alle drei F-box Kandidaten induziert. Zusätzlich wurde der F-box Kandidat in einem zweiten YTH System, welches auf dem Transkriptionsfaktor Gal4 basiert, sowie einem in vitro Interaktionsnachweis dem Glutathion-S-Transferase "Pull-down" auf P25 Interaktion getestet und diese bestätigt.

Aufgrund einer Zelltodreaktion, die bei der Interaktion des P25 mit dem unvollständigen F-box Protein im BiFC auftrat, wurde die induzierte Expression von verschiedenen „pathogenesis related proteins“ in Tabak überprüft und somit die Induktion einer HR durch das F-box Kandidatengen nachgewiesen. Für eine Bestätigung, dass es sich bei diesem charakterisierten Kandidaten tatsächlich um ein F-box Protein handelt, wurden im YTH System Interaktionen mit ausgewählten Proteinen des sogenannten SCF-Komplexes, einer E3 Ligase vorgenommen.

Dieser Komplex des Proteasoms nimmt die Erkennung von zu degradierenden Proteinen vor und leitet anschließend ihren Abbau durch das 26S Proteasom ein.

Von diesem aus SKP1, Cullin und F-box bestehenden Komplex wurden orthologe SKP1 Proteine aus A. thaliana (ASK1, ASK2) auf Interaktionen mit dem F-box im Gal4-basierten YTH System untersucht und erfolgreich bestätigt. Die identifizierten F-box Proteine beinhalten zum einem eine „F-box" Domäne zum andere zwei

"kelch-repeat" Motive. Um die Funktionen dieser detaillierter zu charakterisieren, wurden Deletionsmutanten des F-box Kandidaten erstellt. Dafür wurde das F-box Protein in seine funktionellen Domänen „F-box“ und „kelch repeats“ geteilt und auf Interaktion in Hefe, sowie Zelltodreaktion mittels Agroexpression analysiert. Die hergestellten Deletionsmutanten zeigten weder eine Interaktion im YTH System mit P25 noch eine Zelltodreaktion in Blattparenchymzellen von Tabak. Die beschriebenen Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Anwesenheit aller Domänen des F-box Proteins für eine P25 Interaktion sowie die Auslösung von HR notwendig ist. Eine detaillierte Darstellung der Untersuchungen ist im vierten Teil dieser Arbeit zusammengestellt.

ZUSAMMENFASSUNG

Um eine mögliche funktionelle Beteiligung von den in dieser Arbeit identifizierten Kandidaten an der pflanzlichen Erkennung des viralen Pathogenitätsfaktors P25 zu charakterisieren, stellen weitere YTH Analysen eine Möglichkeit dar.

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