Das Ziel dieser Arbeit war es, ein bioaktives Material aufzubauen, welches auf verzweigter DNA beruhte.
Mehrere Herausforderungen mussten gemeistert werden, um zu diesem Ziel zu gelangen. Zuallererst mussten die Bausteine für die automatisierte DNA Synthese synthetisiert werden. Zwei Synthesewege wurden erarbeitet, um verschiedene chemisch modifizierbare Gruppen am Verzweigungspunkt anbringen zu können.
Zur Synthese der verzweigten DNA wurden drei verschiedene Strategien getestet. Da unvermeidbarer Weise auch inverse DNA Synthese durchgeführt werden musste, wurden zwei Strategien getestet, die nur einen der drei Stränge mittels dieser weniger effizienten Syntheseverfahren herstellten. Diese beiden Strategien beruhten auf der Verbrückung zweier DNA-Stränge auf dem Trägermaterial. Jedoch konnte dieser Syntheseschritt nicht effizient durchgeführt werden, sodass von diesen Strategien abgelassen wurden. Bei der dritten Synthesestrategie wurden zwei DNA-Stränge parallel mittels inverser DNA Synthese hergestellt. Um Verluste durch schlechte Ausbeuten zu verringern, wurde im Vorfeld die Synthesizer-Chemie optimiert. Vor allem der Austausch des Aktivator-Reagenz von Ethylthio-1H-tetrazol zu 4,5-Dicyanoimidazol hatte eine durchschlagende Verbesserung der Syntheseausbeuten zur Folge.
Die enzymatische Verlängerung der verzweigen Primer wurde optimiert, vor allem in Hinblick auf die oberflächenbasierte Anwendung. Die Konzentrationen an Additiven wie DMSO und BSA wurde optimiert. BSA ist ein gängiges Passivierungsmittel in vielen molekularbiologischen Anwendungen, die auf Oberflächen beruhen.
Die PCR wurde auf Objektträgern durchgeführt. Dazu musste DNA auf diesen immobilisiert werden. Vor allem die unspezifische, elektrostatische Interaktion von DNA mit der Glasoberfläche musste verhindert werden.
Passivierungsverfahren wurden entwickelt, mit denen die unselektive Interaktion weitestgehend verhindert werden konnte. Die selektive Anbindung von DNA konnte jedoch erfolgen.
Um die DNA-Netzwerke funktionalisieren zu können, waren bioorthogonale Reaktionen nötig. Die Kupfer katalysierte Azid-Alkin-Zykloaddition und die Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf wurden getestet. Bei der
Click Reaktion wurden verschiedene Liganden getestet, wobei sich BTTAA als den anderen überlegen darstellte. Protokolle wurden etabliert, mittels denen die verzweigte DNA effizient modifiziert werden konnte. Auch die interne DNA Modifikation wurde untersucht. Alkin-modifizierte dNTPs wurden auf Einbau durch KlenTaq-DNA Polymerase untersucht und die so modifizierten DNA Stränge mittels Click Chemie modifiziert. Die für verzweigte DNA entwickelten Methoden konnten erfolgreich auch auf dieses System übertragen werden.
Die interne DNA Modifikation wurde auch mit Diels-Alder Reaktion untersucht. Dazu wurden zwei vinylierte dNTPs synthetisiert und deren Einbau in die DNA getestet. Beide Nukleotide wurden gut eingebaut, jedoch konnte nur das Adenosin-derivat nach dem Einbau noch über die Zykloaddition funktionalisiert werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit war hierbei sogar größer am DNA Duplex als am Nukleosid. Die Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf stellte sich folglich als sehr interessante Reaktion im Hinblick auf die Anwendung heraus.
Mit der Funktionalisierungschemie in Händen konnten nun die Fängermoleküle aufgebracht werden. Als Fängermolekül wurde ein zyklisches Peptid, cRGDfK, ausgewählt. Dieses Peptid präsentiert das RGD-Motiv, ein universelles Anheftungsmotiv in vielzelligen Organismen. Viele verschiedene Zelltypen können an dieses Peptid binden, welches als azid-funktionalisierte Form hergestellt wurde.
Objektträger-gebundene DNA-Netzwerke konnten erstellt werden, welche dieses Peptid präsentierten. In „Proof-of-concept“ Studien konnte in HeLa-Zell-Kultur gezeigt werden, dass ca. doppelt so viele Zellen an das modifizierte DNA Netzwerk binden als an unmodifiziertes DNA Netzwerk. Bei Ausübung von Stress und verlängerter Inkubationszeit konnten sogar bis zu 7-mal mehr Zellen an die funktionalisierten Netzwerke binden.
Abschließend ist zu sagen, dass ein bioaktives, Glasträger gebundenes DNA Netzwerk erzeugt werden und in einem einfachen Experiment die Anwendbarkeit gezeigt werden konnte.
Da diese ersten Experimente sehr vielversprechend waren, sollten die Eigenschaften dieser Netzwerke noch weiter untersucht werden. Die Maschengröße der Netzwerke könnte zum Beispiel variiert werden, da damit der relative Abstand zwischen den Fängermolekülen reduziert werden würde.
Zu erwarten ist, dass sich hierbei einige physikalische Eigenschaften des Materials verändern. So ist beispielsweise die Festigkeit des Materials
abhängig von der Maschengröße. Somit kann versucht werden, das Material mit seinen Eigenschaften auf bestimmte Zielzellen maßzuschneidern.
Da nun auch orthogonale Ligationsreaktionen mit der DNA verfügbar sind, können die Netzwerke auch multiplex modifiziert werden, also mit einem Fängermolekül und einem Molekül, das das genetische Programm der Zielzellen verändert, z. B. mit Wachstumsfaktoren. Dies könnte eine wertvolle Methode sein, um Stammzellen gerichtet differenzieren zu können.
Des Weiteren könnten diese Netzwerke auch interessante Substrate für Zell-Netzwerke sein, da diese üblicherweise beim Ablösen vom Wachstumssubstrat zerstört werden. Mit einem DNA-basierten Substrat könnte dieses mittels Enzymen verdaut werden, sodass die Zellen sehr milde abgelöst werden können.
Sobald Fängermoleküle für EPCs verfügbar sind, könnten diese synthetisiert werden, sodass diese mittels Ligationsreaktionen auf die Netzwerke übertragen werden. Diese Substrate wären dann im Hinblick auf biomedizinische Anwendungen interessant. Transplantate könnten mit einem solchen Material beschichtet werden, sodass die EPCs aus dem Blut gebunden werden. Diese differenzieren dann zu Epithelzellen aus, sodass das künstliche Material dann unter einer Hautschicht verborgen ist.
Alles in allem eröffnet dieses Material die Möglichkeit für vielfältige fortgeschrittene Zellkultur und für biomedizinische Anwendungen.