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178 9. Zusammenfassung
bindet Indinavir auf den ersten Blick sehr ähnlich im aktiven Zentrum beider Proteasen (HTLV-1- und HIV-1-Protease): das ausgebildete Wasserstoffbrücken-Netzwerk zwischen beiden Proteasen ist annähernd gleich und liefert zunächst keine direkte Erklärung für den so deutlichen Affinitätsunterschied. Dahingegen scheinen insbesondere die van der Waals-Interaktionen, die von den hydrophoben Gruppen des Indinavirs ausgebildet werden, im Fall der HTLV-1-PR weniger vorteilhaft im Vergleich zur HIV-1-Protease zu sein.
In einem zweiten Ansatz zur Leitstrukturidentifizierung wurde das Konzept der
„privilegierten Strukturen“ zur Identifizierung neuartiger niedermolekularer Grund-gerüste für die HTLV-1 PR-Inhibition verfolgt. Durch Screening der Arbeitskreis-internen Substanzbibliothek verschiedener Aspartylproteaseinhibitoren konnten C2 -symmetrische 3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierte Pyrrolidine sowie bizyklische Pyrrolidine als vielversprechende Kandidaten zur Inhibition der HTLV-1-Protease identifiziert werden. Beide Inhibitorklassen wurden ursprünglich als HIV-1-Protease-Inhibitoren entwickelt und im Rahmen dieser Arbeit bezüglich ihrer enzymkinetischen und strukturellen Eigenschaften gegenüber der HTLV-1-Protease genauer untersucht.
Aus einer Serie mit zehn C2-symmetrischen 3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierten Pyrrolidinen stellt die Verbindung AB84 mit einer Affinität von 15 nM nicht nur den affinsten Vertreter dieser Serie, sondern, nach bestem Wissen, auch den bislang affinsten nicht-peptidischen HTLV-1-Protease-Inhibitor dar. Die erfolgreiche Bestim-mung der Kristallstrukturen von AB84 sowie AB83, einem weiteren Vertreter dieser Inhibitorklasse, ermöglichte ebenfalls die strukturbasierte Interpretation der Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) und legt somit den Grundstein für die weitere strukturbasierte Leitstrukturoptimierung. Die Kristallstrukturen ermöglichten ebenfalls die Interpretation der Affinitätsunterschiede nicht nur innerhalb der Inhibitorserie, sondern darüber hinaus auch im Vergleich zur HIV-1-Protease.
Die bizyklischen Pyrrolidin-basierten Inhibitoren weisen Affinitäten im drei- bis einstellig micromolaren Bereich auf, wobei die mit zwei Benzhydrylgruppen substituierte Verbindung NK232 der bisher aktivste Vertreter dieser Inhibitorserie (Ki: 1,4 µM) ist.
Eine Kristallstruktur dieser Verbindungsklasse wurde mit NK101 erfolgreich bestimmt.
Obwohl der HTLV-1-Protease-NK101-Komplex nur eine moderate Auflösung aufwies, lieferte er dennoch erste wertvolle Informationen über den Bindungsmodus dieser Substanzklasse in der HTLV-1-Protease.
Basierend auf den erhaltenen, grundlegenden Erkenntnissen über den Bindungsmodus sowie der abgeleiteten SAR bieten beide Grundgerüste vielversprechende Optionen für die weitere strukturbasierte Leitstrukturoptimierung.
9. Zusammenfassung 179
Abbildung 9.1. Neuartige Grundgerüste zur HTLV-1-Protease-Inhibition: aus dieser Arbeit hervorge-gangene vielversprechende Startpunkte für eine strukturbasierte Leitstrukturoptimierung.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Aspartylprotease Endothiapepsin, einem bekannten Modellenzym für Aspartylproteasen. Verschiedene Verbindungen mit einem 2-Amino-Thiophen Grundgerüst wurden basierend auf der Gewald-Reaktion synthetisiert. Überraschenderweise wurden innerhalb einer Serie von acht strukturell sehr ähnlichen Liganden vier verschiedene Bindungsmodi gefunden, was im Nachhinein erklärt, warum die auf den Affinitätsdaten und der Kristallstruktur der Leitstruktur basierte SAR nicht schlüssig interpretiert werden konnte. Dieses Beispiel unterstreicht eindrucksvoll die Komplexität des Bindungsgeschehens von Liganden und
Serie von zehn Inhibitoren:
Ki: >250µM – 15nM
zwei Kristallstrukturen im
Komplex mit der HTLV-1-PR Kristallstruktur von NK101 im Komplex mit der HTLV-1-PR Serie von zehn Inhibitoren:
Ki: 215µM – 1.4µM
NK232 Ki: 1.4µM AB84 Ki: 15nM
AB83 AB84 NK101 Indinavir C2-symmetrische
3,4-bis-N-alkylsulfonamid-Pyrrolidine
Pyrrolidin-basierte Bizyklen
Ki: 3.5µM Kristallstruktur (2.4Å)
180 9. Zusammenfassung
dessen Abhängigkeit von kleinsten chemischen Veränderungen am Substitutions-muster einer Leitstruktur. Strukturbasiertes Wirkstoffdesign beruht auf der korrekten Interpretation der zugrundeliegenden SAR, und somit ist nicht nur die anfängliche Bestimmung der Kristallstruktur(en) im Komplex mit einer/mehreren Leitstruktur(en) von größter Bedeutung, sondern ebenfalls die Überprüfung des angenommenen Bindungsmodus während des Leitstrukturoptimierungsprozesses. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Unstimmigkeiten bei der Korrelation von klassischen Affinitäts- mit TSA-Daten als Hinweis auf Kandidaten dienen können, für die eine Überprüfung des Bindungsmodus lohnenswert sein könnte, auch wenn ein vermeintlich zugrundeliegender Bindungsmodus bekannt zu sein scheint. Die hier präsentierte Fallstudie unterstreicht die Notwendigkeit der kontinuierlichen Überwachung der Bindungsmodi während eines Leitstrukturoptimierungsprozesses und stellt die im Allgemeinen angenommene Hypothese, dass strukturell ähnliche Liganden in ähnlicher Weise binden, in Frage.
Abbildung 9.2. Wechselnde Bindungsmodi von Gewald-Reaktions-basierten Aspartylprotease-Inhibitoren:
eine beeindruckende Fallstudie für die strukturbasierte Leitstrukturoptimierung stellt gängige Design-Paradigmen in der Medizinischen Chemie in Frage.
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Acknowledgment
Mein herzlicher Dank gilt meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Wibke E. Diederich für die interessante Aufgabenstellung, die bei der Bearbeitung gelassenen Freiräume, die es mir erlaubt haben meine eigenen Ideen zu verfolgen, die konstruktiven Gespräche, das sorgfältige und geduldige Korrekturlesen der Papermanuskripte, sowie für die Unterstützung und stetige Hilfsbereitschaft während der gesamten Promotionszeit. Es war eine schöne, lehrreiche und produktive Zeit.
Ich danke Herrn Prof. Dr. Klaus Reuter für die Organisation und Leitung des S1-Labors, das offene Ohr für S1-bezogene Fragestellungen und für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.
Herrn Prof. Dr. Carsten Culmsee und Herrn Prof. Dr. Jens Kockskämper danke ich für die bereitwillige Übernahme des Prüfungsvorsitzes und der Nebenfachprüfungen.
Herrn Prof. Dr. Gerhard Klebe möchte ich für die Nutzung des S1-Labors und der Computersoftware danken.
Mein herzlicher Dank gilt meinen Kooperationspartnern: Ich danke Dr. Holger Steuber für die Einführung in die Welt der Kristallographie und für die Verfeinerung der zahlreichen Kristallstrukturen. Ich danke Dr. Andreas Blum und Dr. Nina Klee für die Bereitstellung der synthetisierten HIV-1-Protease-Inhibitoren. Für die Synthese des Assaysubstrats danke ich Dr. Kornelia Hardes.
Meinen ehemaligen und aktiven Kollegen im AK Diederich danke ich für die schöne und ausgelassene Atmosphäre, die gute Zusammenarbeit und die tolle Zeit auch außerhalb des Laboralltags.
Ich danke Steffi Dörr für die Einarbeitung im S1-Labor, welche eine erfolgreiche in-house Etablierung des neuen Targets ermöglicht hat und stets für fröhliche Stimmung im S1 Labor gesorgt hat.
Für die weitgehenden fachlichen Diskussionen, Eure Hilfe und Unterstützung während meiner Promotionszeit und nicht zuletzt für die erholsamen Abende möchte ich mich
182 Acknowledgment
insbesondere bei Nina Klee, Frithjof Scheer, Helena Rimmer und Jessica Jüngel bedanken.
Bedanken möchte ich mich auch bei Hans-Dieter Gerber für das Korrekturlesen der Papermanuskripte und die Aufnahme des eiligen qHNMRs.
Dr. Alexander Wlodawer danke ich für die zur Verfügungstellung des HTLV-1 Plasmids, was uns die Initiierung des HTLV-1 Projekts ermöglicht hat.
Meinen Vertiefern danke ich für die hilfreiche Unterstützung, insbesondere möchte ich mich bei Markus Lakemeyer für sein großes Engagement bedanken.
Ich danke Lydia Hartleben für die Unterstützung und Geduld bei allen administrativen Angelegenheiten.
Ich möchte mich bei den Computer-Administratoren der AG Klebe insbesondere bei Felix Gut, Michael Betz, Timo Krotzky, Felix Terwesten und Phong Nguyen bedanken.
Reiner Müller danke ich für die hilfreichen Tipps im Fachbereichsdschungel, inkl. der jährlichen Suche nach den Waagen.
Ich danke den Wissenschaftlern der Beamline BESSY II (Berlin) für die Betreuung der Beamline und dem Helmholtz-Zentrum für Materialien und Energie (Berlin) für die freundliche Übernahme der Reisekosten.
Vielen Dank an die Mitarbeiter der Analytik-Abteilungen des Fachbereichs Pharmazie für die Durchführung der Serviceleistungen und die freundliche Hilfsbereitschaft bei Problemen und Fragestellungen.
Meinen Eltern, Geschwistern und Freunden danke ich für die bedingungslose und geduldige Unterstützung, die aufmunternden, kraftvollen Worte und die erholsamen Wochenenden. Vielen Dank für den festen Rückhalt, Euer Vertrauen und Verständnis.
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Erklärung
Ich versichere, dass ich meine Dissertation
„Synthesis, Identification, Kinetic, and Structural Characterization of Inhibitors of the Aspartic Proteases HTLV-1 Protease and Endothiapepsin”
selbständig ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen bedient habe. Alle vollständig oder sinngemäß übernommenen Zitate als solche gekennzeichnet.
Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken gedient.
Marburg, den...
...
(Maren Kuhnert)