Die Aktivierung von Blutplättchen spielt sowohl während der physiologischen Hämostase als auch bei pathologischen Prozessen wie der intraarteriellen Thrombenbildung und des damit verbundenen Gefäßverschlusses eine zentrale Rolle.
Einer der wichtigen Aspekte der Plättchenaktivierung ist die Dynamik und Umorganisation des Zytoskelettes nach Stimulation der Thrombozyten. Die morphologischen und funktionellen Veränderungen der Plättchen erfordern eine drastische Umorganisation des Aktin-Zytoskelettes, welches durch eine Vielzahl Aktin-bindender Proteine und Signalmoleküle, wie zum Beispiel Moleküle der Familie der Rho-GTPasen, gesteuert wird. Die kleine GTPase Rho reguliert verschiedenste Zellfunktionen, hauptsächlich durch ihren nachgeschalteten Effektor Rho-Kinase.
Einer der Signaltransduktionswege der Rho-Kinase verläuft über die Phosphorylierung der myosin light chain (MLC) und deren Gegenspieler der MLC-Phosphatase. Ein zweiter Signalweg involviert die Aktivierung von LIM-Kinasen (LIMK) und die nachfolgende Phosphorylierung und Inaktivierung von Cofilin, einem Aktin dynamisierendem Protein.
Dephosphorylierung und Aktivierung von Cofilin resultiert in einer Spaltung und Depolymerisation von Aktinfilamenten.
Es ist bisher nicht untersucht worden, ob während der Thrombozytenaktivierung der Signalweg über die Rho-kinase/LIM-kinase/Cofilin-Phosphorylierung aktiviert wird und wie die Cofilinaktivierung die Aktindynamik, welche der Plättchenaktivierung zugrunde liegt, beeinflusst. Um diese Fragestellungen zu beantworten wurde der physiologische Agonist Thrombin und der pathophysiologisch relevante Agonist Lysophosphatidsäure (LPA), welche als thrombogene Substanz in atherosklerotischen Plaques enthalten ist, als Plättchenstimuli eingesetzt und die nachfolgende Regulierung des Rho-Kinase/LIM-Kinase/Cofilin-Phosphorylierungsweges untersucht.
In unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Aktivierung der Rho-Kinase für einen Anstieg des F-Aktin-Gehaltes während der kalziumunabhängigen Konformationsänderung der Thrombozyten, induziert durch LPA oder Thrombin, von Bedeutung ist. Die Aktivierung der Rho-Kinase war einer Sekretion der Plättchengranula und einer Integrin αIIbβ3-Aktivierung vorgeschaltet. Die schnelle Aktivierung der Rho-Kinase führte während der Sekretion der Granulainhaltstoffe und der Thrombozytenaggregation zu einem vermehrten Anstieg des F-Aktin-Gehaltes im Vergleich zum shape change. Es konnte beobachtet werden, dass die durch LPA stimulierte Sekretion der dichten Granula in den Plättchen hauptsächlich durch Rho-Kinase reguliert wurde, während die Sekretion die durch Thrombin induziert wurde, nur teilweise Rho-Kinase abhängig war. Diese Resultate zeigen zusammen, dass Rho-Rho-Kinase den F-Aktin-Anstieg, der einer Formänderung und der Sekretion der Plättchen zu Grunde liegt, reguliert, aber nicht direkt an der Aggregation beteiligt ist.
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Zum ersten Mal konnte durch diese Arbeit gezeigt werden, dass Plättchen nur LIMK-1 exprimieren und nicht LIMK-2. Erstere kann durch die Rho-Kinase sowie durch p21-aktivierte Kinasen (PAKs) aktiviert werden. Wir konnten zeigen, dass die LIMK-1 Aktivierung in stimulierten Plättchen ausschließlich von der Rho-Kinase abhängig ist. Obwohl eine PAK1/2 Aktivierung während des stimulierten shape change beobachtet werden kann, sind in LPA-stimulierten Plättchen PAKs wahrscheinlich nicht an einer LIMK-1-Aktivierung beteiligt. Es wurde gezeigt, dass die LIMK-1-Aktivierung genau wie die Rho-Kinase-Aktivierung unabhängig von der Integrin αIIbβ3-Aktivierung ist und die Rho-Kinase-Aktivierung einer LIMK-1-Aktivierung vorgeschaltet ist.
Überraschenderweise führte die durch Thrombin und LPA aktivierte LIMK-1 nicht zu einem Anstieg der Phosphorylierung von Cofilin während des shape change. Durch Hemmung des Rho-Kinase/LIM-Kinase Signalweges wurde eine Cofilin-Dephosphorylierung deutlich, was darauf hindeutete, dass die gleichzeitige Stimulierung von Cofilin-Phosphatasen der Wirkung einer LIMK-1 vermittelten Cofilin-Phosphorylierung entgegenwirkt. Während der LPA- und Thrombin-induzierten Plättchensekretion und Aggregation wurde Cofilin zuerst sehr schnell dephosphoryliert und anschließend, infolge der LIMK-1 Aktivierung, rephosphoryliert. Nach Stimulation mit LPA und Thrombin unter Bedingungen, unter denen keine Plättchen-aggregation auftritt, war die Cofilin-Phosphorylierung und Dephosphorylierung unverändert, was zeigt, dass Kinetik des Cofilin-Phosphorylierungszyklus unabhängig von der Integrin αIIbβ3 Einbindung ist.
Weiterhin wird durch diese Ergebnisse gezeigt, dass die Cofilin-Dephosphorylierung unabhängig von der Sekretion abläuft und dieser vorgeschaltet ist, da die Dephosphorylierung von Cofilin ebenso schnell wie die Sekretion in Thrombin-stimulierten Plättchen auftrat und auch in Abwesenheit einer dichten Granula-Sekretion nachgewiesen werden konnte, wenn Plättchen ohne Fibrinogen mit LPA (10 µM) stimuliert wurden. Da die Kinetik des Cofilin Phosphorylierungszyklus ähnlich in LPA- als auch in Thrombin-stimulierten Plättchen ist, schlage ich einen generellen Zwei-Schritt Regulationsmechanismus vor: Zuerst eine Dephosphorylierung durch eine Cofilin-Phosphatase und nachfolgend eine Rephosphorylierung durch den Rho-Kinase/ LIMK-1 Signalweg. Dieser Cofilin-Phosphorylierungszyklus reguliert primär die Sekretion und sekundär die Aggregation.
Unsere Beobachtungen, die zeigen, dass nur dephosphoryliertes, aktiviertes Cofilin an F-Aktin bindet, stützen vorherige Resultate, dass der Cofilin-Phosphorylierungsstatus die F-Aktin-Assoziation bestimmt. Der Effekt von Y-27632 in ruhenden Plättchen, welches eine Reduktion der Cofilin Phosphorylierung, einen F-Aktin-Anstieg und eine Steigerung in der Cofilin-Aktin-Assoziation bewirkt, lässt vermuten, dass die LIMK-1 vermittelte Cofilin-Phosphorylierung den F-Aktin Gehalt und auch die Cofilin-Aktin-Assoziation in ruhenden Plättchen reduziert. Die Situation ist anders als in aktivierten Thrombozyten: hier zeigte das Cofilin, welches keine Veränderung seiner Phosphorylierung während des Gestaltwandels von Plättchen aufwies, eine schnelle Assoziation mit F-Aktin. Die maximale Cofilin-Aktinzytoskelett-Interaktion fand vor
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dem maximalen F-Aktin-Anstieg statt, was auf eine Regulation des Aktin-turnover und der Aktinpolymerisation durch Cofilin während der Konformationsänderung der Thrombozyten hinweist. In bisherigen Studien an anderen Zellen wird die Dephosphorylierung von Cofilin, also dessen Aktivierung, vor allem mit einer Aktindepolymerisation in Verbindung gebracht.
Hingegen konnten wir in unseren Studien belegen, dass während der Anfangsphase der Thrombin induzierten Sekretion eine Cofilindephosphorylierung mit einem enormen Anstieg des F-Aktin-Gehaltes und einer starken Cofilin-F-Aktin-Interaktion assoziiert war. Durch die Rephosphorylierung von Cofilin 30 Sekunden bis 2 min nach Stimulation zeigte sich kein Rückgang im F-Aktin-Gehalt oder in der Assoziation von Cofilin mit dem Aktin-Zytoskelett.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse die Komplexität der Regulation der Cofilin-Phosphorylierung und dessen Assoziation mit F-Aktin.
Die schnelle Cofilin-Dephosphorylierung in Plättchen wurde durch eine Okadaic-Säure insensitive Phosphatase katalysiert. Die Aktivierung dieser Phosphatase schien zumindest teilweise durch einen Anstieg des intrazellulären Kalziums und durch die PI3-Kinase reguliert zu sein. Die Enzyme, die den Cofilin-Phosphorylierungs-Dephosphorylierungszyklus regulieren, welcher der Sekretion der Plättchengranula und der Plättchenaggregation vorgeschaltet ist, könnten als potentielle medikamentöse Ziele für antithrombotische Medikamente dienen
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