Zusammenfassung

5. Zusammenfassung

Nukleinsäuresequenzen können ein breites Spektrum an verschiedenen Sekundärstrukturen annehmen; zu ihnen zählt unter anderem der sogenannte Guanin-Quadruplex (G-Quadruplex). Diese nicht-kanonische Struktur kann von Guanin-reichen Nukleinsäuresequenzen ausgebildet werden, welche eine Abfolge von mindestens vier G-Tracts aufweisen. Bioinformatische Analysen ergaben, dass potentielle G-Quadruplex bildende Sequenzen vermehrt in funktionellen Regionen wie z. B. in der telomerischen Sequenz, in der Promotorregion vieler Gene, besonders von Proto-Onkogenen, aber auch in den 5´ und 3` nicht-translatierten Regionen (UTR) von mRNAs vorkommen. Zur Aufklärung der Struktur sowie der Funktionen von G-Quadruplex bildenden Sequenzen wurden zahlreiche in vitro und in vivo Studien durchgeführt. Diese Studien zeigten, dass G-Quadruplexe eine polymorphe Struktur aufweisen, und lieferten Hinweise auf die Beteiligung von G-Quadruplexen an der Regulation verschiedenster zellulärer Prozesse, wie beispielsweise der Transkription, der Translation, der Replikation oder der Integrität von Telomeren. Dennoch bleiben viele Fragen bezüglich der strukturellen Eigenschaften und der Funktionen von G-Quadruplexen unbeantwortet. Diese Dissertation versucht daher, weitere detailliertere Einblicke in die Struktur und Funktionen von G-Quadruplexen zu gewähren.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss einer RNA G-Quadruplex bildenden Sequenz, welche jeweils an unterschiedlichen Positionen innerhalb der 5` UTR einer Reporter-mRNA inseriert wurde, auf das Expressionslevel des Reportergens analysiert. In diesem zellbasierten Reportersystem konnte ein positionsabhängiger Einfluss der natürlich vorkommenden RNA G-Quadruplex bildenden Sequenz von MAPK2 auf die Expression des Reportergens gezeigt werden. Nachfolgend wurde mit Hilfe dieses Systems untersucht, ob sowohl potentielle RNA G-Quadruplex bindende Proteine als auch die bereits bekannten DNA G-Quadruplex bindenden niedermolekularen Substanzen 360A, Phen-DC3 und Phen-DC6 vermögen, die Stabilität des MAPK2 RNA G-Quadruplexes zu beeinflussen. Während der Knock-down von möglichen RNA G-Quadruplex bindenden Proteinen via siRNAs keinen eindeutigen Einfluss auf

das Expressionslevel des Reportergens zeigte, konnte anhand einer Reduktion der Reportergenexpression nachgewiesen werden, dass die drei niedermolekularen Substanzen 360A, Phen-DC3 und Phen-DC6 die untersuchte RNA G-Quadruplex Struktur innerhalb der 5´ UTR binden und stabilisieren können.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels einer in vivo crosslinking Methode versucht, Proteine zu identifizieren, welche mit der möglichen G-Quadruplex bildenden Sequenz der telomeric repeat containing RNA (TERRA) interagieren.

Es wird vermutet, dass TERRA, das Transkript der humanen telomerischen Sequenz, eine wesentliche Rolle bei der Organisation der Telomere einnimmt.

Unglücklicherweise konnten jedoch auf Grund von experimentellen Problemen keine mit TERRA interagierenden Proteine identifiziert werden. Nichtsdestotrotz könnte die hier verwendete Methode sehr gut dazu geeignet sein, um Proteine, welche in vivo mit TERRA interagieren, zu identifizieren.

Der dritte Teil dieser Arbeit widmete sich der Frage, in wieweit sowohl die Anzahl der G-Tracts, als auch die Anzahl und Zusammensetzung flankierender Nukleotide eines DNA G-Quadruplexes seine thermische Stabilität beeinflussen. Vorangegangene Studien ergaben, dass ein RNA G-Quadruplex, welcher in seiner Sequenz mehr als vier G-Tracts (fünf bzw. sechs G-Tracts) enthielt, eine höhere thermische Stabilität aufwies, obgleich angenommen wird, dass lediglich vier der Tracts an der Ausbildung eines intramolekularen G-Quadruplexes beteiligt sind. Die in dieser Arbeit angestellte Untersuchung von DNA G-Quadruplex Sequenzen mit vier, fünf oder sechs G-Tracts mittels CD Spektroskopie und CD Schmelzpunktanalyse zeigte, dass der stabilisierende Effekt zusätzlicher G-Tracts, welcher für RNA G-Quadruplexe beobachtet wurde, nicht eins zu eins auf DNA Quadruplexe übertragbar ist: DNA Quadruplexe, die aus Quadruplex bildenden Sequenzen mit vier oder fünf G-Tracts gebildet wurden, unterschieden sich in ihrer thermischen Stabilität nicht, jedoch wies die DNA G-Quadruplex bildende Sequenz mit sechs G-Tracts eine niedrigere thermische Stabilität des gebildeten G-Quadruplexes auf. Um den Einfluss von Nukleotiden, welche nicht an der Ausbildung des G-Quadruplexes beteiligt sind, auf die thermische Stabilität eines DNA G-Quadruplexes zu

5. Zusammenfassung

untersuchen, wurde durch gezielte Punktmutationen die Bildung eines DNA Quadruplexes in DNA Quadruplex bildenden Sequenzen mit mehr als vier G-Tracts entweder am 5´ Ende, am 3´ Ende oder in der Mitte der Sequenz erzwungen. Zusätzlich wurden systematisch Adenosin(e) oder Thymidin(e) an das 5´ oder 3´ Ende einer DNA G-Quadruplex Sequenz bestehend aus vier G-Tracts angehängt. Die erlangten Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von flankierenden Nukleotiden für die thermische Stabilität eines DNA G-Quadruplexes. Sie zeigten, dass die ersten beiden flankierenden Nukleotide am 5´ Ende zu einer thermischen Stabilisierung des G-Quadruplexes beizutragen scheinen, hingegen am 3´ Ende lediglich das Hinzufügen eines einzelnen Adenosins eine schwache Stabilisierung des G-Quadruplexes zur Folge hat.

Das Hinzufügen weiterer Nukleotide sowohl am 5´ Ende, als auch am 3´ Ende führte jedoch zu einer Destabilisierung der G-Quadruplex Struktur. Generell fiel der stabilisierende Effekt für flankierende Nukleotide am 5´ Ende stärker aus als für flankierende Nukleotide am 3´ Ende. Des Weiteren war zu beobachten, dass die thermische Stabilisierung der G-Quadruplex Struktur durch Adenosine stärker als die durch Thymidine war. Die stabilisierenden Effekte der flankierenden Nukleotide sind wahrscheinlich π-π Interaktionen mit den äußeren G-Tetraden des G-Quadruplexes geschuldet. Weniger detaillierte Untersuchungen, die den Einfluss von flankierenden Nukleotiden auf die thermische Stabilität eines RNA G-Quadruplexes analysierten, ließen einen vergleichbaren Einfluss auf die thermische Stabilität des RNA G-Quadruplexes wie bei dem entsprechenden DNA G-Quadruplex vermuten.

Im letzten Teil dieser Arbeit wurden mit Hilfe einer auf FRET-basierenden Methode in zwei verschiedenen Substanzbibliotheken niedermolekulare Substanzen identifiziert, welche mit dem von der humanen telomerischen DNA Sequenz gebildeten G-Quadruplex interagieren und diesen zu stabilisieren vermögen. Die anschließende detaillierte Analyse dieser niedermolekularen Substanzen via CD Spektroskopie, CD Schmelzpunktanalyse und kompetitiver Schmelzpunktanalyse verifizierte ihr Potential als G-Quadruplex stabilisierende Liganden und zeigte ihre Spezifität für die durch die humane telomerische Sequenz gebildete G-Quadruplex Struktur gegenüber doppelsträngiger DNA.

Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten DNA G-Quadruplex Liganden

könnten daher als mögliche Leitstrukturen der Entwicklung von hoch spezifischen G-Quadruplex Liganden dienen.