Humanes Vollblut ist eine gut zugängliche Quelle für primäre Immunzellen und Plasmakomponenten, welche an Immunabwehrreaktionen beteiligt sind. Es kann sowohl genutzt werden, um die humane Abwehrreaktionen gegen Mikroben und ihre pyrogenen Komponenten zu studieren als auch um in einer Probe eine pyrogene Kontamination durch die Messung eines repräsentativen entzündlichen Parameters nachzuweisen. Letztere Möglichkeit wurde genutzt, um eine Methode zu entwickeln, durch die durch Beprobung von Filtern mit Luftproben deren pyrogene Belastung beurteilt werden kann. Da Pilzsporen einen großer Anteil an luftgetragenen Mikroben darstellen, wurde ihr Anteil an der pyrogenen Belastung der Luft beurteilt indem ihre entzündliche Aktivität charakterisiert und beteiligte Moleküle und Mechanismen untersucht wurden.
Ferner wurde die Strategie, Pyrogene aus der Luft auf einer Festphase zu sammeln, weiterentwickelt, um es zu ermöglichen durch den Einsatz von Albumin-gekoppelten Mikrosphären, Pyrogene in toxischen oder immunmodulatorischen Medikamenten nachzuweisen und um die Nachweisgrenze des Tests so zu erniedrigen, dass auch geringe Pyrogene Belastungen in Dialyseflüssigkeiten und grossvolumigen Parenteralia nachgewiesen werden können.
1. Eine Luftsammelmethode wurde etablieret, um Pyrogene aus der Luft auf Filtermembranen zu sammeln und um die Zytokinausschüttung von Blutzellen als Reaktion auf diese Filter zu beurteilen. Dazu wurde auch ein entsprechendes Referenzmaterial für Feldstudien generiert. Diese zeigten eine gute Korrelation zwischen der Menge an lebenden Mikroben in der Luft und der entzündlichen Aktivität der Luft. Spenderanalysen zeigten, dass Allergiker eine abweichende Immunreaktion im Verglich zu Nichtallergikern haben. Standardisiertes, kryopräserviertes Blut stellte einen adäquaten Ersatz für Frischblut dar, was es ermöglicht, die Spendervarianz auszuschlielßen. Der direkte Vergleich dieser neuen Methode mit dem Limulus-Amoebzytenlysat-Test, welcher nur Endotoxine detektiert, zeigte dass letzterer wie zu erwarten die Belastung der Luft unterschätzt.
2. Die immunstimulatorische Kapazität von Pilzsporen wurde durch Charakterisierung der Zytokinmuster, die durch sie im humanen Blut induziert wurden, untersucht. Die 44 getesteten Spezies induzierten sehr homogene Zytokinmuster mit ähnlicher Kinetik, was nahe legte, dass Pilzsporen gemeinsame Oberflächenstrukturen besitzen, die vom Immunsystem erkannt werden. Eine Analyse der Spendervarianzen zeigte, dass sowohl die durch Pilze induzierten als auch die durch andere Stimuli induzierten Zytokinmengen hauptsächlich durch die individuelle Monozytenzahl bestimmt werden. Die relative Antwort auf verschiedene Stimuli zeigte sich durchwegs als vergleichbar. Der Vergleich zwischen der Zytokinantwort von humanen Blutzellen mit der von murinen Alveolarmakrophagen zeigte eine starke Korrelation, was darauf hinweist, dass Blutmonozyten und Alveolarmakrophagen ähnlich reagieren.
3. Die Analyse der Rolle von pilzlichen Glykanen durch chemische und enzymatische Spaltung stellte ihre vorgeschlagene Rolle als immunstimulatorisches Prinzip von Schimmelpilzen in Frage. Die Untersuchung der TLR-Abhängigkeit der Immunerkennung von Schimmelpilzen durch den Einsatz von Zellen aus entsprechenden knock-out Mäusen zeigte, dass für deren Erkennung der TLR-2 Rezeptor notwendig ist um das volle Ausmaß an Zytokininduktion zu bewirken.
Interessanterweise unterdrückt das Vorhandensein von TLR-4 die Zytokinproduktion.
4. Die Beteiligung des TLR-2 Rezeptors an der Erkennung von Pilzsporen deutet darauf hin, dass die pilzlichen TLR-2 Agonisten strukturelle Ähnlichkeit mit anderen TLR-2 Agonisten haben könnten. Konidien von Cladosporium cladosporioides wurden einer Butanolextraktion unterzogen und der Extrakt wurde über FPLC und HPLC aufgetrennt. Dadurch konnte ein immunstimulatorisches, amphiphiles Molekül aufgereinigt werden, welches der 1H-NMR Analyse nach aus Alkylketten besteht und möglicherweise Zuckerreste trägt. Diese Verbindung induzierte dieselben Zytokinmuster wie die ganzen Sporen und zeigte auch dieselbe TLR Abhängigkeit. Koinkubationen mit den bekannten LPS-Inhibitoren Polymyxin B und LAL-F beeinflussten die Aktivität der gereinigten
Substanz nicht, aber der LTA Inhibitor PPG 1200 konnte die inflammatorische Kapazität dieser Verbindung dämpfen.
5. Im Zuge der Anpassung des Bluttestes an die Sammlung von Pyrogenen auf einer Festphase, wurde eine Methode entwickelt, mit der Pyrogene aus Flüssigkeiten an Albumin-gekoppelten Mikrosphären gebunden werden konnten. Dadurch konnten die Pyrogene von immunstimulatorischen oder toxischen Medikamenten getrennt werden.
Nach einem Waschvorgang wurden sie erst mit Blut in Kontakt gebracht.
Es konnte gezeigt werden, dass die Mikrosphären LPS, LTA und zymosan binden und dass die Sensitivität der Detektion mit der des Standardtests für injizierbare Arzneimittel vergleichbar war. Das Vermögen dieses Tests, Pyrogene in schwertestbaren Medikamenten nachzweisen wurde anhand von einigen Beispielen nachgewiesen: Paclitaxel, Gentamicin, Prednisolone, liposomales Amphotericin B und liposomales Daunorubicin.
6. Durch weitere Modifikationen des Versuchsaufbaus konnten geringe Mengen an Pyrogenen auf den Mikrosphären gesammt werden. Dadurch wurde die Sensitivität des Tests um den Faktor 250 erhöht, was den Nachweis von Pyrogenen in Dialyseflüssigkeiten und in großvolumigen Medikamenten ermöglicht.
Die Tests, die in dieser These entwickelt wurden, können dazu beitragen, Risikoeinschätzungen für die pyrogene Belastung am Arbeitsplatz und in Innenräumen zu treffen, die Arzneimittelsicherheit in speziellen Fällen zu verbessern und um chronische Probleme pyrogenen Ursprungs bei Dialysepatienten zu vermeiden.
Die Untersuchung der immunstimulatorischen Aktivitäten von Schimmepilzsporen zeigte, dass Pilze, ähnlich wie negative und Gram-positive Bakterien, gemeinsame Oberflächenstrukturen tragen, welche vom angeborenen Immunsystem erkannt werden. Diese Strukturen scheinen entgegen früheren Vorschlägen, amphiphile Moleküle zu sein. Ein besseres Verständnis von der Interaktion zwischen den Pilzen und dem Immunsystem, könnte Ansatzpunkte für neue Therapeutika liefern.