Zusammenfassung des Präparationsprotokolls

Abschließend erfolgt eine Zusammenfassung des Präparationsprotokolls mit den jeweiligen Schritten und erforderlichen Zeiträumen für die entsprechenden Präparationsschritte.

1. Vorbereitung des Versuchstiers vor Organentnahme

Zu Beginn des Präparationsprozesses erfolgt die intraperitoneale Injektion verdünnten Heparins. Dieser Schritt erfolgt, um ein Einsetzen der Blutgerinnung infolge des Abbruchs der Blutzirkulation nach Euthanisierung des Tieres vor Organentnahme zu vermeiden, da durch diese ein Verschluss der für eine Präparation notwendigen Koronargefäße riskiert würde. Für die Resorption des injizierten Heparins sowie der Verteilung im Körperkreislauf wurde eine Dauer von 10 Minuten gewählt.

2. Euthanisierung, Organentnahme und Fixierung des Organs auf der Perfusionskanüle Es schließt sich die cervikale Dislokation des Tiers mit anschließender Organentnahme und Fixierung des Herzens auf der Perfusionskanüle an. Nach manueller Injektion weniger Milliliter PBS zur Kontrolle der korrekten Positionierung der Aorta auf der Perfusions- kanüle, die sich durch Erblassen der oberflächlichen Herzvenen zeigt, wird mit der Ent- fernung löslicher Bestandteile durch Perfusion des Organs begonnen. Es wurde eine Dauer der Perfusion mit gekühltem PBS von 10 Minuten gewählt.

3. Chemische Fixierung und Hybridisierung des Gewebes

Nach Wechsel des Substrats schließt sich die chemische Fixierung durch zwanzigminütige Perfusion von PFA an. Ein Auswaschen ungebundener PFA - Moleküle wird durch zwanzigminütige PBS - Perfusion im darauffolgenden Schritt erreicht. In Vorbereitung der Hydrogelpolymerisierung wird das Organ mit gekühlter 4%iger Acrylamidlösung in einem geschlossenen Kreislauf zwei Stunden perfundiert. 30 Minuten vor Abschluss der Acrylamidperfusion wird mit dem Erwärmen der Probe auf 37° C im Wärmeschrank begonnen. Parallel erfolgen das Ansetzen des Polymerisierungsinitiators und dessen Erwär-men in einem 37° C warErwär-men Wasserbad. Durch fünfminütige Perfusion mit PBS werden ungebundene Acrylamidmoleküle entfernt, während bereits mit der Einspeisung gasförmi-gen Stickstoffs zur Verdrängung von Sauerstoffmolekülen aus dem Polymerisierungs- initiator begonnen wird. Es folgt der Wechsel des Perfusats von PBS zu Polymerisierungs-initiator unter Fortsetzung der Stickstoffzufuhr, ehe nach fünfminütiger Perfusion des Initiators die Stickstoffzufuhr beendet und Öffnungen der in den Kreislauf geschalteten Gefäße geschlossen werden, um ein Eindringen von Sauerstoff zu reduzieren. Nach einer

104 Perfusionsdauer von insgesamt 50 Minuten kann die Polymerisierungsreaktion beendet werden.

4. Klärung des Gewebes durch SDS - Behandlung

Im weiteren Verlauf der Klärung wird die Behandlung des Organs mit SDS sowohl als Perfusat, als auch als Inkubationsmedium fortgesetzt. Die Dauer dieser Behandlung kann je nach gewünschtem Klärungsgrad des Organs variieren. Dabei zeigten sich teils deutliche interindividuelle Unterschiede zwischen den präparierten Organen, sodass ein Zeitraum von vier Tagen als orientierender Wert angesehen werden kann. Sofern sich eine vollständige, bzw. ausreichende Klärung des Organs nach diesem Zeitraum noch nicht eingestellt hat, kann die Behandlungsdauer durch Substratwechsel zurück zu SDS verlängert werden. Nach Abschluss der SDS - Behandlung werden Rückstände des SDS durch Perfusion und Inkubation des Herzens in PBS für 24 Stunden entfernt.

5. Färbung der Organstrukturen

Sofern die Organpräparation und Klärung mit dem Ziel einer histochemischen Darstellung zellulärer bzw. extrazellulärer Strukturen erfolgte, wurden die notwendigen Färbungen des Präparats in der Regel nach Abschluss des SDS - Clearings durchgeführt, wobei auch bereits in brechungsindexangleichender Lösung inkubierte Organe nach Auswaschen des stark vis-kösen Mediums erfolgreich gefärbt werden konnten (Abb. 37). Die zur Färbung der Organe benötigte Zeitspanne hängt im Wesentlichen von der geplanten Art der Einbringung der Agentien in das Präparat ab. Während perfusionsgestützte Verfahren bereits Doppelfärbungen, bzw. Färbungen gegen unterschiedliche Strukturmerkmale innerhalb eines Tages ermöglichen, benötigen rein inkubationsbasierte Verfahren mitunter Tage bis Wochen, abhängig von der geplanten Anzahl unterschiedlicher Färbungen innerhalb eines Organs, der pro Färbung notwendigen Schritte sowie der Diffusionsgeschwindigkeit der Stoffe über die Gewebeschichten hinweg und damit verbunden nicht zuletzt der Größe des Präparats (Vgl. Abb. 32, 33). In Bezug auf die Diffusionsgeschwindigkeit ergaben sich teils deutliche Unterschiede zwischen den eingesetzten Agentien. Im Fall der beispielhaft zur Darstellung infarzierter Areale eingesetzten GOLDNER - Färbung war bereits nach einem Tag eine vollständige Durchdringung des Organs erreicht (Abb. 31, 32). Im Gegensatz dazu konnten durch Färbungen mittels Lektinen oder Antikörpern innerhalb eines Tages nur Schichten von wenigen hundert Mikrometern durchdrungen werden, wodurch die benötigte Inkubationsdauer, auch unter Berücksichtigung folgender Waschschritte, zunimmt (Abb. 33).

105 6. Erhöhung der Organtransparenz durch Inkubation in brechungsindexangleichenden Medien

Den letzten Schritt innerhalb des Klärungsprotokolls stellt die Angleichung des Brechungsindex zwischen Immersionsmedium und Organ dar. Hierzu wurde 80%ige Sorbitollösung verwendet. Eine Perfusion dieser Lösung zeigte sich aufgrund der hohen Vis-kosität als nicht geeignet. Mitunter ließen sich bereits nach weniger als 24 Stunden Inkubation gute Ergebnisse im Hinblick auf die Transparenz des Organs erzielen. Aufgrund des hohen Viskositätgrads der Sorbitollösung und der damit verbundenen reduzierten Diffusionsgeschwindigkeit wurde eine mittlere Inkubationsdauer von 4 - 7 Tagen vor der geplanten Bildgebung gewählt. Abweichungen von diesen Zeiten können sich ergeben, so-fern nur Veränderungen der Organoberfläche beobachtet werden sollen oder eine Auf- trennung des Organs, beispielsweise in die beiden Herzhälften, möglich ist, da sich hierdurch die Diffusionsstrecke sowie die für Lichtsignale zu passierenden Präparatebenen reduzieren lassen und geringere Ansprüche an die Organtransparenz möglich sind.

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