Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden neue bioabbaubare Polymere für den Transport von Nukleinsäuren bezüglich ihrer biophysikochemischen Eigenschaften charakterisiert. Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2) untersuchten wir die Komplexierung und den Aggregationsmechanismus von Nukleinsäuren mit Polykationen auf atomarer und molekularer Ebene unter Verwendungen der molekularen Modellierung, molekulardynamischen Simulation, isothermen Titrationskalorimetrie und anderen Charakterisierungsmethoden, um die Frage zu beantworten, warum ein guter pDNA-Vektor nicht unbedingt eben so gut für siRNA funktioniert. Diese Daten zeigten uns sehr unterschiedliche natürliche Eigenschaften und den hierarchischen Mechanismus der Komplexbildung von Polykationen/siRNA und Polykationen/pDNA. Mit der folgenden

Untersuchung der Beziehung zwischen dem

Nukleinsäuren/Polykationen-Aggregationsmechanismus und der

in-vitro-siRNA-Delivery-Effizienz, konnten wir zeigen, dass niedrige N/P-Verhältnisse (Stickstoff/Phosphat) exzellente siRNA-Delivery-Effizienz ermöglichen, dies wurde aber in den bisherigen Untersuchungen für siRNA-Transfektion mit Polykationen vernachlässigt.

In Kapitel 3 wurden neue bioabbaubare, amphipathische Copolymere hy-PEI-g-PCL-b-PEG durch die Kupplung von PCL-b-PEG-Ketten auf dem hyper-verzweigten Poly(ethylenimin) als nicht-virale Gentransfer-Vektoren charakterisiert. Der Einfluss der Kupplungsdichten von PCL-b-PEG-Ketten auf physikalisch-chemische Eigenschaften, DNA-Komplexierung und Transfektionseffizienz wurde untersucht und diskutiert. In dieser Studie wurde keine Korrelation zwischen den Größen der Polyplexe und Transfektionseffizienz gezeigt, während sich die Puffer-Kapazität, Zytotoxizität und Zeta-Potential als die entscheidenden Faktoren für Erklärung der Ergebnisse der Gentransfektion erwiesen. Von allen experimentellen Ergebnissen, zeigte die Puffer-Kapazität fast genau die gleiche Tendenz wie die Transfektionseffizienz. Wir gehen daher davon aus, dass in allen Prozessen der DNA-Transfektion, der „endosomal escape“ eine wichtige und geschwindigkeitsbestimmende Rolle spielt.

Weitere Untersuchungen dieser biologisch abbaubaren amphipathischen Copolymere hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n als potentiale siRNA-delivery Vektoren wurden in Kapitel 4 berichtet.

Der Zweck der Untersuchungne dieses Kapitels war, die in vivo Blutzirkulationszeit und die siRNA Transfektionseffizienz der bioabbaubaren Copolymere hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n zu erhöhen. Unsere Studie zeigte, dass die Wirkung von PEG auf längere Blutzirkulationszeit nicht nur vom prozentualen Inhalt in einem Copolymer abhängt, sondern auch von der Struktur oder Form des Copolymers. Die Polymere-Mizellen, die mit amphipathischen Blockpolymeren entstehen, haben Vorteile für siRNA Transfektion z.B. effektive in vivo siRNA Transfektion und verlängerte Blutzirkulation. Im Kapitel 5, wurde das mit der Folsäure konjugierte Polymer PEI-g-PCL-b-PEG-Fol bezüglich seiner biophysikochemischen Eigenschaften charakterisiert.

Geringere Zytotoxizität wurde bei PEI-g-PCL-b-PEG-Fol beobachtet. Die zelluläre Aufnahme wurde durch die Kupplung von Folsäure verbessert. Wichtig ist, dass diese Verbesserung durch freie Folsäure gehemmt wurde, und dass diese Verbesserung auch nicht in Folat-Rezeptor-negativen A549-Zellen beobachtet wurde. Alle Daten bestätigen die Aufnahme der

PEI-g-PCL-b-PEG-Fol/pDNA Polyplexe über Folat-Rezeptor-vermittelte Endozytose. Die in vitro DNA Transfektionseffizienz wurde deutlich erhöht durch die Kupplung von Folsäure. Die zusätzlichen Untersuchungen in vivo und Nutzung dieser beschriebenen Folat-konjugierten Copolymeren für gezielte siRNA Transfektion sind in Bearbeitung.

In Kapitel 6 wurden hyperflexible Triazin-Dendrimere der Generationen 2-4 als neuartige siRNA-Delivery-Systeme bezüglich ihrer physikalisch-chemischer und biologischer in vitro und in vivo Eigenschaften untersucht und diskutiert. In diesem Kapitel wurden die thermodynamische Eigenschaften durch molekulare Modellierung simuliert, und der Einfluss der Flexibilität wurde systematisch untersucht und diskutiert.

In Kapitel 7 wurden neuartige bioabbaubare und biokompatible Polymere der Zusamensetzung Poly (PEG-co-(BMDO-co-DMAEMA) für die Gen-Transfektion erfolgreich bezüglich ihrer physikalisch-chemischen und in vitro biologischen Eigenschaften charakterisiert. Die quarternierten Copolymere zeigten niedrige Zytotoxizität als die quarternisierten Copolymere sowie positive Ergebnisse in der DNA-Transfektion in vitro.

Weiterentwicklungen der beschriebenen nicht-virale Gen-Transfektion-Systeme sind immer denkbar. In Kapitel 2 haben wir die Komplexierung und den Aggregationsmechanismus von Nukleinsäuren mit Polykationen auf atomarer und molekularer Ebene untersucht. In diesem Projekt wurden molekularen Modellierung, molekulardynamische Simulation, isotherme Titrationskalorimetrie und andere Charakterisierungsmethoden angewendet. Trotzdem besteht immer Bedarf für neue Untersuchungsmethode zur Charakterisierung der pDNA- oder siRNA-Lokalisierung innerhalb der Komplexe. Es ist daher sinnvoll, neue mikroskopische Methoden weiterzuentwickeln.

In Kapitel 3 haben wir anhand der Untersuchung des Einflusses der Kupplungsdichten von PCL-b-PEG-Ketten auf physikalisch-chemische Eigenschaften, DNA-Komplexierung und Transfektionseffizienz gefunden, dass der „endosomal escape“ eine sehr wichtige Rolle für die Gen-Transfektion spielt. Und ein Design oder eine Optimierung des Polymers mit einer höherer Puffer-Kapazität könnte sich in Zukunft als sehr sinnvoller weisen.

In Kapitel 3-5 werden die Copolymer hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n als neuartige Transfektionpolymere beschrieben. In dieser Untersuchung wurden nur Copolymere mit kurzen PCL-Segmenten

(Gewicht von 570 Da) untersucht. Es wäre daher noch sehr interessant, den Einfluss der langen PCL-Segmente in dieser Struktur zu diskutieren.

In Kapitel 5 wurden Folsäure-gekuppelte PEI-g-PCL-b-PEG-Konjugate charakterisiert, und verbesserte pDNA Transfektion wurde beobachtet im Vergleich mit unmodifiziertem Polymer. Die beschriebenen Vektoren mit Targeting-Liganden sind sicherlich wert, Weiter in vivo für siRNA untersucht zu werden, welches besonders sinnvoll wäre für die Entwicklung der Gentransfektion in der Lunge.

Kationische Quantenpunkte (QDs) können für die weitere Untersuchung der siRNA-Freisetzung benutzt werden. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Effekt zwischen fluoreszenzmarkierter siRNA und mit QDs geladenen Polymeren könnte nachgewiesen werden, wenn die siRNA innerhalb der Polymere kondensiert wird.

Diese multifunktionalen Gen-Transport-Systeme mit höherer siRNA-Verkapselung und höherem Schutz-Effizienz, besserer Biokompatibilität und Transfektionseffizienz sowie zusätzlichem Targeting-Effekt und langer Blutzirkulation sind jedoch eine Herausforderung für das Gebiet der Genetherapie innrehalb der Krebsforschung. Die “magic bullet” Vision von Paul Ehrlich vor über 100 Jahren beginnt sich bei fortgesetzter Forschung und Entwicklung zu verwirklichen.