Zusammenfassende Betrachtung von episomaler Plasmid-DNA

Episomale Plasmid-DNA

5.3 Zusammenfassende Betrachtung von episomaler Plasmid-DNA zum stabilen

Experiment wurde der Einfluss der G418-Konzentration auf die Transgenexpression untersucht. Durch eine G418-Konzentration von 1000 µg/ml Medium kann zwar eine höhere relative Transgenexpression erreicht werden, allerdings ergeben sich dadurch auch deutlich inhomogenere Werte. Durch die resultierende hohe Standardabweichung lässt sich daher bei der Verwendung von G418 in den Konzentrationen 1000 µg/ml und 500µg/ml kein signifikanter Unterschied feststellen. Während durch Anwendung von Selektionsdruck nach in vitro-Transfektion des pEPI1-Luc Vektors Langzeit-Transgenexpression erreicht werden konnte, war bereits acht Tage nach in vivo Applikation des Vektors zur Transfektion der Lunge keine Luciferaseaktivität mehr detektiertbar.

Um die Möglichkeit zu untersuchen, selbstreplizierende Vektoren durch die Kombination geeigneter Promotoren mit der huINF β-S/MAR zu erhalten, die keinerlei initiale Selektion mehr benötigen, wurden verschiedene Konstrukte kloniert und deren Fähigkeit, stabile Transgenexpression zu vermitteln, getestet.

Zunächst wurde der Einfluss der huINF β-S/MAR in Kombination mit dem Promotorelementen CMV-enhancer, Ubiquitin B-Promotor, sowie dem Ubiquitin B-Intron in vitro durch Transfektionen der Vektoren pCUBIBLuc und pEPICUBIBLuc bezüglich der vermittelten Langzeit-Transgenexpression untersucht. Durch die Transfektion von pEPICUBIBLuc konnte eine signifikant höhere relative Luciferaseaktivität über einen Zeitraum von 50 Tagen erreicht werden. Dieser Unterschied könnte sowohl durch Silencing, als auch durch fehlende episomale Replikation des pCUBIBLuc Plasmids, verglichen mit pEPICUBIBLuc, begründet sein. Daher wurde im Weiteren der Status der beiden Konstrukte 72 Tage nach Transfektion untersucht. Während episomales pEPICUBIBLuc vorhanden war, konnte keinerlei verbliebene extrachromosomale pCUBIBLuc Plasmid-DNA mehr detektiert werden. Die huINF β-S/MAR vermittelte hier in Kombination mit dem CMV-enhancer, Ubiquitin B-Promotor sowie dem Ubiquitin B-Intron die episomale Replikation des Plasmids, ohne dass Selektion nötig ist.

Episomale Plasmid-DNA

Nach Transfektion der Lunge in vivo durch Injektion von PEI/pDNA Komplexen kann bei Verwendung von CMV-Promotor-enthaltenden Plasmiden in der Regel eine Transgenexpression über maximal eine Woche detektiert werden (Aneja et al., 2007). Während durch den CMV-Promotor-enthaltenden Vektor pEPI1-Luc in vivo keine verlängerte Transgenexpression vermitteln werden konnte (siehe 5.1.3;

Conese et al., 2004), konnten nach intravenöser Applikation von pEPICUBIBLuc und pCUBIBLuc über einen Zeitraum von 49 Tagen Transgenexpression beobachtet werden. Auch sechs Monate nach Injektion von pEPICUBIBLuc konnte in den isolierten Lungen aller Mäuse noch Luciferaseaktivität detektiert werden, während für pCUBIBLuc nur noch Luciferaseexpression in einer Maus beobachtet werden konnte. Bei der Quantifizierung der in der Lunge vorhandenen episomalen Plasmid-DNA ergab sich hier allerdings kein Unterschied zwischen pEPICUBIBLuc und pCUBIBLuc. Beide Konstrukte konnten klar als episomale Vektoren in den Mauslungen sechs Monate nach Transfektion nachgewiesen werden. Dies korreliert mit neusten Untersuchungen zur Zellteilungsrate von Lungenepithelzellen, die mit bis zu 18 Monaten angegeben wurde (Rawlins and Hogan, 2008). Der Verbleib der Plasmid-DNA Kostrukte im Lungengewebe über sechs Monate war daher zu erwarten. Da bereits gezeigt werden konnte, dass Silencing durch die Assoziation der huINF β-S/MAR mit der Expressionskassette im episomalen pEPI1 Vektor in vitro reduziert ist, ist anzunehmen, dass auch Silencing in vivo durch die huINF β-S/MAR teilweise verhindert wird. Dies erklärt die unterschiedlichen Expressionsmuster von pEPICUBIBLuc und pCUBIBLuc trotz Vorhandensein beider Vektoren nach sechs Monaten in vivo.

Durch die Injektion von PEI/pDNA-Komplexen in die Schwanzvene von Mäusen wird nicht nur Lungen-, sondern mit geringerer Effektivität auch Lebergewebe transfiziert. Interessanterweise konnte bei der Bestimmung der Luciferaseaktivität im Lebergewebe bei allen Mäusen Luciferaseaktivität, unabhängig vom verwendeten Plasmid, beobachtet werden. Episomale Plasmid-DNA wurde allerdings nur in zwei der mit pEPICUBIBLuc transfizierten Mäusen detektiert.

Dies deutet darauf hin, dass Plasmid-DNA auch integriert wurde und hier die Transgenexpression vermittelte. Da durch Transfektion von pEPICUBIBLuc in der

Leber höhere Expressionslevel erreicht wurden als mit pCUBIBLuc, könnte auch bei integrierter Plasmid-DNA ein inhibitorischer Effekt der huINF β-S/MAR auf das Silencing angenommen werden. Es konnte gezeigt werden, dass bei nach systemischer Applikation von l-PEI/pDNA-Komplexen sowohl Nekrosen als auch Zelltod im Lebergewebe auftraten, während das Lungengewebe weitgehend unbeschädigt blieb (Chollet et al., 2002). Dies könnte die unterschiedlichen Ergebnisse bezüglich der vorhandenen episomalen Plasmid DNA in Lunge und Leber erklären.

Für Plasmide, deren Transgenexpression durch den Ubiquitin C-Promotor gesteuert wird, konnte nach in vivo-Transfektion stabile Expression und die Assoziation des Vektors mit Histonen des Euchromatins festgestellt werden (Riu et al., 2007). Daher wurden die Vektoren pEPIUbCLuc und pUbCLuc kloniert und bezüglich ihres Expressionsmusters sowie episomaler Replikation in vitro und in vivo charakterisiert.

Durch die Anwendung initialen Selektionsdrucks konnte sowohl für pEPIUbCLuc, als auch für pUbCLuc stabiler Gentransfer und Transgenexpression über einen Zeitraum von über 60 Tagen erreicht werden. Wie bereits bei Transfektion von pEPI1-Luc beobachtet, sank die Luciferase-Expression zunächst während der Dauer der Selektion ab, stieg anschließend allerdings auf ein vergleichsweise deutlich höheres Niveau von bis zu 5,5-fach der initialen Expression an. Im Gegensatz zur pEPI1-Luc vermittelte pEPIUbCLuc auch ohne Selektionsdruck stabile Transgenexpression, wenn auch auf niedrigerem Level als mit Selektion. Hier wurde eine relative Luciferaseaktivität von circa 20 Prozent der initialen Werte gemessen. Dabei ergab sich allerdings auch ein signifikanter Unterschied zum Vektor pUbCLuc, der eine relative Luciferaseexpression von bis lediglich fünf Prozent vermittelte. Um zu prüfen, inwieweit die Transgenexpression von episomaler Plasmid-DNA stammen könnte, wurde der Status der DNA zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Hierbei ergab sich grundsätzlich für beide Plasmide eine stetig abnehmende Menge an Plasmid-DNA. Während allerdings acht Tage nach Transfektion für pEPIUbCLuc noch

Episomale Plasmid-DNA

circa 1/3 und für pUbCLuc immerhin noch 1/6 der initial transfizierten Menge an Plasmid Molekülen festgestellt werden konnte, konnte ein dramatischer Verlust beider Konstrukte zum Zeitpunkt Tag 45 nach Transfektion festgestellt werden. So verblieb lediglich 0,00012 Prozent pEPIUbCLuc und 0,000049 Prozent pUbCLuc als episomale Plasmid-DNA in den Zellen. Die in der Literatur beschriebene episomale Replikation durch die huINF β-S/MAR kann für den unterschiedlich starken Verlust an Plasmid-DNA im Verlauf nach Transfektion als Erklärung herangezogen werden. Allerdings konnte 45 Tage nach Transfektion im Mittel lediglich in jeder dritten Zelle ein Molekül pEPIUbCLuc detektiert werden. Diese geringe Menge war allerdings ausreichend, um stabile relative Transgenexpression von 20 Prozent ohne Selektion über einen Zeitraum von mehr als 60 Tagen zu vermitteln. Dies erhält besondere Bedeutung im Vergleich mit dem Vektor pEPI1. Dieser ist nach Selektion im Mittel in einer Menge von fünf Molekülen pro Zelle vorhanden (Jenke et al., 2004) und vermittelte stabile relative Transgenexpression von bis zu 25 Prozent (5.1.1). Offensichtlich kommt es im Falle des pEPIUbCLuc durch den Ubiquitin C-Promotor im Vergleich zu pEPI1-Luc deutlich weniger zu Gen-silencing.

Bei der Anwendung der Vektoren pEPIUbCLuc und pUbCLuc in vivo ergab sich nach Applikation von PEI/pDNA-Komplexen eine verlängerte Transgen-expression durch pEPIUbCLuc in der Lunge. Allerdings konnte auch für dieses Plasmid nach Tag 28 keine Luciferaseaktivität in vivo mehr festgestellt werden.

Um hier den Einfluss von Polyethylenimin als Transfektionsreagenz auf die Transgenexpression auszuschließen, wurde nackte Plasmid-DNA im Mausmodell zur Transfektion des Nasenepithels mittels Perfusion verwendet.

Interessanterweise kam es hier zu einem deutlich veränderten Expressionsverlauf für pEPIUbCLuc. Während die durch pUbCLuc vermittelte relative Luciferase-Expression innerhalb von 15 Tagen auf ein stabiles Niveau von circa 20 Prozent absank, stieg die Transgenexpression im Falle von pEPIUbCLuc zunächst auf einen maximalen Wert von 220 Prozent nach 15 Tagen. Im weiteren Verlauf sank diese dann bis Tag 50 nach Transfektion auf das gleiche Niveau wie die durch pUbCLuc vermittelte Luciferaseaktivität. Es ergab sich durch die Applikation

nackter pEPIUbCLuc Plasmid-DNA also ein veränderter Verlauf der Transgenexpression verglichen mit der Transfektion mittels PEI.

Während der in der Literatur als episomal-replizierend beschriebene Vektor pEPI1 in den Untersuchungen weder in vitro ohne Selektionsdruck noch in vivo Langzeit-Transexpression vermittelt, konnte gezeigt werden, dass dies durch die Verwendung unterschiedlicher Promotoren und Transkriptions-verstärkender Elemente möglich ist. Hierbei zeigte sich, dass wiederum die Einführung der huINF β-S/MAR am 3’-Ende des Transgens im Plasmid die Expression verstärken und teilweise auch zu verlängern vermag. Insbesondere unter Kontrolle einer Kombination aus CMV enhancer, Ubiquitin B-Promotor und Ubiquitin B-Intron konnte für den S/MAR enthaltenden Vektor pEPICUBIBLuc hohe Transgenexpression über einen Zeitraum von mehreren Wochen ohne Anwendung von Selektionsdruck beobachtet werden. Auch in vivo konnte nach sechs Monaten erhöhte Transgenexpression, verglichen mit dem S/MAR-freien Vektor pCUBIBLuc, gezeigt werden, obwohl in der Menge der vorhanden episomalen Plasmid-DNA kein Unterschied festgestellt wurde. Die huINF β-S/MAR verringert hier also das Silencing des Transgens.

Zusammenfassung