ZmMADS2 gehört zur AGL17 Subfamilie der MADS-Box Gene und reguliert die Pollen- und Antherenreifung

4.2. ZmMADS2 gehört zur AGL17 Subfamilie der MADS-Box Gene und

AGL17

AGL12

AG

SQUA AGL2 GLO DEF

AGL6 AGL15 TM3

Abb. 4.1: Auszug aus dem phylogenetischen Stammbaum der Familie der MADS-Box Gene aus Angiopspermen

ZmMADS2 gehört zur AGL17-Unterfamilie der MADS-Box Gene. Mitglieder dieser Gruppe wurden zum Teil aus genomischen Sequenzdaten abgeleitet. Die anderen Unterfamilien sind jeweils durch ihre Namensgeber sowie MADS-Box Gene aus Mais (mit Rahmen) repräsentiert. Der Name der jeweiligen Unterfamilie ist rechts angegeben. Der Balken repräsentiert eine Abweichung der Aminosäuren-Sequenz von 10%.

0.1

IbMADS

MsMADS-Fragment ANR1

DEFH125 ZmMADS2 OSJNBa

AGL17 AGL21

AGL16 At3g AGL12 putative-JrMADS AGAMOUS

ZMM2 ZAG1 ZMM1 ZAG2 APETALA1 ZmMADS3

PISTILLATA DEF APETALA3 AGL6

AGL15 ZmMADS1

Arabidopsis Genom zeigten, daß die AGL17-Unterfamilie wahrscheinlich noch weitere, bisher nicht untersuchte Mitglieder aufweist (Abb. 4.1).

Mitglieder einer monophyletischen Einheit weisen im Allgemeinen neben hoher Sequenz-Homologie auch große Ähnlichkeiten in ihrer Funktion sowie in den Expressionsmustern auf.

Die AGL17-Unterfamilie scheint eine Ausnahme zu sein, da die Mitglieder in jeder Hinsicht starke Unterschiede zeigen. ZmMADS2 und DEFH125 sind in den letzten Stadien der Antheren- und der Pollenreife sowie im wachsenden Pollenschlauch stark exprimiert, eine sehr schwache Expression von ZmMADS2 konnte in Wurzelspitzen und Wurzeln ohne Spitzen nachgewiesen werden. Die Mitglieder der Subfamilie aus Arabidopsis und ein Vertreter aus Luzerne sind Wurzel(-Organ) spezifisch exprimiert, während das einzige bekannte Mitglied dieser Unterfamilie aus der Kartoffel in allen vegetativen Geweben exprimiert ist. Im Zusammenhang mit der Evolution der Landpflanzen wird vermutet, daß sich die Expressionsmuster von MADS-Box Genen der höheren Pflanzen aus universell exprimierten Vorfahren entwickelt haben, wie sie z. B. in Farnen zu finden sind (Theißen et al., 2000). Durch Duplikation und die Rekrutierung der entstandenen Gene für unterschiedliche Aufgaben könnten sich zeitlich und räumlich spezifischen Expressionsmuster entwickelt haben (Alvarez-Buylla et al., 2000). Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß Pollen und Wurzeln beide polares Spitzenwachstum zeigen, bei dem die Kerne der Zellen in die wachsende Spitze einwandern. Versuche, eine einheitliche Theorie der Regulation dieser Vorgänge zu bestimmen, zeigten jedoch viele Unterschiede in beiden Systemen auf (Franklin-Tong, 1999). So kann beispielsweise das Pollenschlauchwachstum als amöboide Bewegung der vegetativen Zelle aufgefaßt werden, während die Zellen der Wurzel in ihrem Entstehungsgewebe verankert bleiben. Im Gegensatz zur sporophytischen Wurzelspitze stellt der männliche Gametophyt einen eigenständigen Organismus dar. Die Zellkerne im Gametophyten sind außerdem haploid, die der Wurzelzellen diploid.

Hauptaufgabe der Wurzeln ist Aufnahme und Weiterleitung von Nährstoffen und Wasser aus dem Boden, wohingegen der Pollenschlauch einzig dem Transport der Spermzellen zum Embryosack dient.

Das Vorhandensein zahlreicher metabolischer cis-Elemente im ZmMADS2-Promotor deutet darauf hin, daß die Expression von ZmMADS2 durch die Nährstoffkonzentration innerhalb der Zelle reguliert wird. Die ANR1-Expression wird ebenfalls durch Nährstoffkonzentrationen reguliert (Zhang und Forde, 2000). G-Boxen innerhalb des ZmMADS2-Promotors und die Expression während des Zelltods deuten auf eine Aktivierung durch Streßfaktoren hin. Diese treten ebenfalls bei einer Infektion des Wurzelgewebes auf, die die Expression von NMHC5

in Luzerne auslöst. Weitere Gemeinsamkeiten lassen sich zwischen ZmMADS2 und AGL17 finden: beide Gene sind in Wurzelspitzen exprimiert. AGL17 markiert die Wurzelhaube, deren Zellen nach wenigen Tagen Lebensdauer dem programmierten Zelltod unterliegen und ZmMADS2 markiert die Apoptose in Zellen des Endotheciums und des Konnektivs. Beide Proteine erscheinen im Zusammenhang mit dem programmierten Tod von Zellen, der für das Überleben der Pflanze, bzw. ihrer Nachkommen notwendig ist.

Die Insertion eines Wurzel-spezifischen Gens in das ZmMADS2-Intron 2 könnte die ZmMADS2-Expression in der Wurzelspitze beeinflussen. Regulatorische Elemente können in beiden Orientierungen (sense und antisense) aktiv sein (Xie et al., 2001). Bei der Expression des in Intron 2 inserierten Gens sind cis-Elemente in dessen Promotorbereich, der mit Teilen der K-Box von ZmMADS2 überlappt, von Transkriptionsfaktoren besetzt. Diese könnten in geringem Maße auch eine Transkription in der entgegengesetzten Richtung aktivieren. Gegen eine alleinige Aktivierung der ZmMADS2-Expression in Wurzelspitzen durch den Promotor des inserierten Gens spricht jedoch, daß keine transgenen Pflanzen regeneriert werden konnten, die das ZmMADS2::Barnase-Konstrukt integriert hatten. Einfachen Eukaryonten, wie z. B. Hefe, besitzen relativ kleine Genome, in denen kodierende Sequenzen häufig überlappen oder in entgegengesetzter Orientierung angeordnet sind. In Achlya klebsiana wurde die gleichzeitige Expression eines sog. "Antisense-Genpaares" nachgewiesen. Ein Strang des betreffenden DNA-Fragments kodiert für eine NAD-spezifische Glutamat Dehydrogenase und der komplementäre Strang für ein Hitzeschock-Protein (LeJohn et al., 1994). In Hefe wurde gezeigt, daß die Transkription von zwei konvergent angeordneten Genen gestört wird, wenn die Leserahmen überlappen (Puig et al., 1999). Prescott und Proudfoot (2001) demonstrierten jedoch, daß eine Störung der Transkription nur auftritt, wenn beide Gene von dem selben DNA-Strang kodiert werden. Eine Störung der Expression von ZmMADS2 durch das inserierte Gen in der Wurzel erscheint somit unwahrscheinlich.

Es ist bekannt, daß aus dem Tapetum sekretierte Stoffwechselprodukte die Mikrosporenentwicklung stark beeinflussen. Mutationen, bei denen die Zellen des Tapetums betroffen sind, führen zu männlicher Sterilität (z.B. Koltunow et al., 1990; Okada et al., 1999;

Kapoor et al., 2002). Im Endstadium der Pollenentwicklung sind Tapetum und Zwischenschicht vollständig degeneriert und die Antherenkammern vom Endothecium umgeben. Es erscheint daher wahrscheinlich, daß die nunmehr innere Schicht der Antherenwand die Pollenreifung beeinflußt oder das Austrocknen beider Gewebe durch den selben Mechanismus reguliert wird. Eine Ausnahme ist z. B. der Tabak, bei dem gezeigt wurde, daß sich männlich sterile Antheren, in denen die Entwicklung des Tapetums gestört

ist, normal öffnen und somit das Aufspringen der Antheren und die Reifung der Pollen unabhängige Ereignisse darstellen (Koltunow et al., 1990; Mariani et al., 1990). Reportergene unter der Kontrolle des ZmMADS2-Promotors konnten sowohl in austrocknenden Antheren als auch im wachsenden Pollenschlauch detektiert werden. Dies deutet darauf hin, daß ZmMADS2 für diese beiden unterschiedlichen Prozesse benötigt wird.

Ein Modell zur Synchronisation von Pollenreifung, Aufspringen der Anthere und Öffnung der Blüte in Arabidopsis wurde kürzlich von Ishiguro et al. (2001) entworfen. Der Import von Wasser aus den Antherenkammern in das Filament fördert die Pollenreifung, eine weitere Wasseraufnahme aus der Antherenwand (Endothecium und Epidermis) führt zum Aufspringen der Anthere und der Verlängerung des Filaments. Bei der Arabidopsis Mutante coi1, die unfähig ist, das Jasmonatsäure-Signal zu detektieren, unterbleibt das Aufspringen der Antheren und die Pflanzen sind männlich steril. Jasmonatsäure wurde daher als Signalmolekül zur Koordination der Ereignisse diskutiert, die zu einer rechtzeitigen Ausschüttung reifen Pollens führen. Der Phänotyp von ZmMADS2-Antisense Pflanzen deutet darauf hin, daß auch hier eine ähnliche Signalkette unterbrochen ist.

Viele sog. späte Pollengene sind neben dem Gametophyten ebenfalls in Geweben der Anthere exprimiert. Transkripte dieser Gene wurden in Tapetum, Zwischenschicht, Endothecium, Epidermis, Stomium, Septum, Konnektiv oder im Filament nachgewiesen. Okada et al. (1999) lokalisierten eine Expression des Ca²⁺ -bindenden Proteins Bra r 1 in Tapetum, Mikrosporen und im Pollenschlauch. Das Protein wird sekretiert und spielt wahrscheinlich eine Rolle bei der Interaktion zwischen Pollen und Stigma. Das Ausschalten des Tapetum-spezifischen Zink-Finger Proteins TAZ1 führte zu vorzeitiger Degeneration des Tapetums und zum Absterben der Mikrosporen (Kapoor et al., 2002). Die Expression des Arabidopsis MS1 Gens kann in geschlossenen Knospen detektiert werden und erreicht ihr Maximum bei der Mikrosporen-Bildung im Tapetum (Wilson et al., 2001). Xu et al. (1992) zeigten, daß zur Regulation der Expression von bgp1 im Tapetum und im Pollen unterschiedliche Sequenzen innerhalb der 5'UTR verwendet werden. Die Arabidopsis Gene DELAYED DEHISCENCE1 (Sanders et al., 2000) und DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (Ishiguro et al., 2001) kodieren beide für Enzyme des Jasmonatsäure-Stoffwechsels, die während der späten Antheren-Entwicklung im Filament akkumulieren. Das lat52 Gen aus der Tomate, welches wahrscheinlich eine Pektin-Lyase kodiert, zeigt ein ähnliches Expressionsmuster wie ZmMADS2. Lat52 ist in sporophytischen Geweben der Anthere, im reifen Pollen, in Wurzelhauben von Primär- und Lateralwurzeln sowie im Endosperm exprimiert. Ein weiteres spätes Pollengen der Tomate, lat59, ist eventuell an der Steuerung von Ablösungsprozessen

beteiligt (Twell et al., 1991). MROS2, ein putatives sekretiertes Zellwand-Protein aus Melandrium album, wird ausschließlich in Endothecium und Konnektiv männlicher Knospen exprimiert (Matsunaga et al., 1996).