Generierung von Mini-LCL-Zelllinien

Zur Immortalisierung von B-Zellen eignet sich besonders das Epstein-Barr-Virus (EBV), das in vitro die Zellen infizieren und transformieren kann. Das Virus induziert das Wachstum einer dauerhaften lymphoblastoiden Zelllinie (LCL, engl. lymphoblastoid cell line) (Pope et al., 1968). Alternativ können B-Zellen mit Hilfe eines gentechnisch veränderten EBV-Stammes transformiert werden, der noch im Stande ist B-Zellen zu infizieren und zu transformieren, aber durch das Fehlen der meisten lytischen Gene nicht mehr in den lytischen Zyklus eintreten kann (Kempkes et al., 1995;

Moosmann et al., 2002). Durch eine EBV-Verpackungs-Zelllinie ist es möglich, ohne das Risiko einer Kontamination durch ein Helfervirus das Replikations-defiziente Mini-EBV-Genom in einer Virionform zu generieren. Diese Virionen können selbstständig B-Zellen infizieren und immortalisieren (Delecluse et al., 1999). Die so transformierten B-Zellen werden als Mini-LCL (mLCL, engl. mini lymphoblastoid cell line) bezeichnet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden B-Zellen in PBMZ eines Spenders anhand des Mini-EBV-enthaltenden Überstandes der Wirtszelllinie B95-8 (periphere Blutlymphozyten des Krallenaffen, freundlicherweise von Andreas Moosmann bereitgestellt) immortalisiert (Miller, G. und Lipman, 1973; Farrell, 2001). Hierfür wurden 1 – 0,5 x 10⁶ PBMZ in 100 µl LCL-Medium mit 100 µl EBV-Überstand und 1 µg/ml Cyclosporin A in einer 96-Loch-Platte (Flachboden) versetzt. Cyclosporin A (CSA) blockiert die Calcineurin-Aktivität, ein Schlüsselenzym der T-Zell-Aktivierung, wodurch die Genexpression verschiedener Zytokine sowie deren Rezeptoren inhibiert wird und dadurch zelluläre Bestandteile des Immunsystems sterben (Mascarell und Truffa-Bachi, 2003). Auf der anderen Seite weist CSA eine unterstützenden Wirkung auf die EBV-Transformation und Entwicklung immortalisierter humaner B-Lymphoyten auf (Walz et al., 1990; Chen et al., 2009). Somit wird eine CSA-vermittelte Selektion auf EBV-transformierte B-Zellen ermöglicht.

3.1.5 Kultivierung von LCL/mLCL-Zelllinien

In stehenden 25 cm² (15 ml Medium) oder 75 cm² (50 ml Medium) Zellkulturflaschen (BD) wurden im Brutschrank (Heraeus) bei 37°C/6,5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit LCL und mLCL in LCL-Medium kultiviert. Die in Suspension wachsenden Zellen wurden etwa alle drei bis fünf Tage 1:5 gesplittet und mit frischem LCL-Medium (12 ml bzw. 40 ml) versetzt.

3 Methoden

3.1.6 Kultivierung adhärenter Tumorzellen

Adhärente humane Tumorzelllinien wie Mel624.38 und MelA375 wurden in liegenden 75 cm² Zellkulturflaschen (BD) mit 20 ml LCL-Medium im Brutschrank (Heraeus) bei 37°C/6,5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Etwa alle drei bis vier Tage wurden die Zellen 1:5 oder 1:10 gesplittet. Hierfür wurde das Medium entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und mit 2 ml 1 x Trypsin/EDTA-Lösung für 5 – 10 Minuten bei 37°C inkubiert, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen. Der Verdau wurde mit 10 ml LCL-Medium abgestoppt. In eine neue Zellkulturflasche wude 1/5 oder 1/10 der gelösten Zellen transferiert und mit LCL-Medium auf ein Endvolumen von 20 ml aufgefüllt.

3.1.7 Kultivierung von Suspensionszellen

Die Tumorzellen K562 sowie LCL/mLCL sind in Suspension wachsende Zellen, die in stehenden 75 cm² Zellkulturflaschen (BD) mit 50 ml LCL-Medium im Brutschrank (Heraeus) bei 37°C/6,5%

CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert wurden. Etwa alle drei bis vier Tage wurden die Zellen 1:5 gesplittet und mit frischem LCL-Medium versehen.

3.1.8 Kultivierung etablierter T-Zellklone

Etablierte T-Zellklone wurden alle 14 Tage restimuliert. Hierfür wurden pro Kavität einer 24-Loch-Flachbodenplatte 1 x 10⁶ T-Zellen mit 1 x 10⁶ bestrahlten PBL vier verschiedener Spender (50 Gy, Bestrahlungsanlage ¹³⁷Cs, HWM-D-2000 Gammacell), 1 x 10⁵ bestrahlten Antigen-präsentierenden Zellen (APZ), 250 ng/ml Phytohämagglutinin (PHA) oder je 30 ng/ml Anti-CD3/-CD28 und 50 U IL-2/ml in 2 ml T-Zellmedium gemischt. Der CD8⁺ T-Zellklon IVSB (Tyrosinase-spezifisch, HLA-A*02:01-restringiert) wurde mit der Melanomzelllinie Mel624.38 (100 Gy, Bestrahlungsanlage ¹³⁷Cs, HWM-D-2000 Gammacell) und der T-Zellklon JB4 (A*02:01-spezifisch) mit einer HLA-A*02:01-positiven mLCL-Linie (mLCL-MRE, 100 Gy, Bestrahlungsanlage ¹³⁷Cs, HWM-D-2000 Gammacell) als APZ stimuliert. Spätestens vier Tage nach Restimulation wurde der PHA-haltige Kulturüberstand abgenommen und durch 2 ml frisches T-Zellmedium mit 50 U/ml IL-2 ersetzt. Im Folgenden wurde alle drei Tage 1 ml Medium pro Kavität durch frisches Medium mit 50 U/ml IL-2 ausgetauscht und wenn nötig die Zellen 1:2 gesplittet. Die T-Zellen wurden an Tag 14 nach Stimulation bei Bedarf wie unter 3.1.2 beschrieben eingefroren.

3 Methoden

3.1.9 Anreicherung von humanen mononukleären Zellen des Blutes (PBMZ) aus Frischblut

Mononukleäre Zellen aus Frischblut wurden anhand der Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung des synthetischen Copolymers Ficoll (Biochrome) angereichert. Das Spenderblut wurde bei Abnahme heparinisiert und anschließend im Verhältnis 1:2 mit sterilem PBS (low endotoxin, Biochrom AG) gemischt, wovon jeweils 35 ml auf 15 ml Ficoll überschichtet wurde.

Nach der Zentrifugation für 18 Minuten bei 840 x g ohne Bremse wurden 15 ml der obersten Phase abgenommen und der Zentrifugationsschritt wiederholt (Thrombozytenwäsche). Danach wurden jeweils zwei Interphasenringe gemischt, mit sterilem PBS auf 50 ml Endvolumen aufgefüllt und für 10 Minuten bei 470 x g mit Bremse zentrifugiert. Jeweils zwei Zellsedimente wurden zusammengeführt und ein weiteres Mal mit sterilem PBS (Endvolumen 50 ml; 470 x g für 10 Minuten mit Bremse) gewaschen. Für die zweite Thrombozytenwäsche wurden erneut zwei Zellsedimente gemischt und jeweils 40 ml PBS mit 0,5% Humanserum dazugegeben und die Zellen resuspendiert. Nach der Zentrifugation für 15 Minuten bei 130 x g ohne Bremse wurde dieser Schritt wiederholt. Anschließend wurden die Zellen in 15 ml DZ-Medium resuspendiert und die Zellzahl bestimmt.

3.1.10 Generierung von 3-Tage DZ (3d-DZ)

Für die Generierung von 3d-DZ wurden zunächst Monozyten mit Hilfe der Plastikadhärenz aus den PBMZ isoliert. Hierfür wurden 75 x 10⁶ PBMZ in 15 ml DZ-Medium in eine 80 cm²-Nunclon^TM Δ Surface-Zellkulturflasche (Thermo Scientific) gegeben und leicht geschwenkt, um die Zellen möglichst gleichmäßig zu verteilen. Nach 25-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die liegende Flasche kurz geschwenkt und für weitere 25 Minuten im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden alle nicht adhärenten Zellen mit dem Überstand entfernt und die adhärenten Zellen mit jeweils 15 ml DZ-Medium durch leichtes Schwenken zweimal gewaschen. Für die Ausreifung zu zunächst unreifen iDZ (engl. immature DC) wurden 15 ml DZ-Medium mit 20 ng/ml IL-4 und 100 ng/ml GM-CSF versetzt und in die Flasche gegeben. Für die Generierung reifer mDZ (engl.

mature DC) wurde am dritten Tag der Maturierungscocktail (siehe Tab. 3.1) in DZ-Medium dazu gegeben. Am vierten Tag war der Reifungsprozess beendet und die DZ konnten für Experimente gesammelt und verwendet werden.

3 Methoden

Tab. 3.1: Zytokinzugabe und Maturierungs-Cocktails für die Generierung von mDZ

Jonoleit-Cocktail¹ Cocktail 5² Cocktail 6³

DZ-Medium 3 ml 6 ml 6 ml

GM-CSF 1800 ng 2100 ng 2100 ng

IL-4 360 ng 420 ng 420 ng

IL-1β 180 ng 210 ng 210 ng

TNFα 180 ng 210 ng 210 ng

INFγ - 105 000 U 105 000 U

R848 - - 21 000 ng

PGE2 18 000 ng 5 250 ng 5 250 ng

Poly(I:C) - 420 ng 420 ng

1 mDZ generiert nach Jonuleit et al. (1997), verkürzt von 7 Tage auf 3 Tage von M. Bürdek (2010)

2 3-Tage-mDZ generiert nach verkürztem Protokoll unter Verwendung von poly(I:C) (Spranger et al. 2010)

3 3-Tage-mDZ generiert nach verkürztem Protokoll unter Verwendung von TLR-Liganden und Poly(I:C) (5C+R848; Spranger et al., 2010)

(Jonuleit et al., 1997; Burdek et al., 2010; Spranger et al., 2010) 3.1.11 Ivt-mRNS-Transfektion verschiedener Zelltypen

Die Zellen wurden mit ivt-mRNS unter Verwendung des „Gene Pulser Xcell™“ (Biorad) in 0,4 cm Elektroporationsküvetten (Biorad) transfiziert. Dazu wurden die Zellen einmal mit kaltem RPMI 1640 (very low endotoxin, Biochrom AG) gewaschen, bei 470 x g zentrifugiert und das Zellsediment in kaltem RPMI aufgenommen, wobei die Zellzahl auf 2 – 3 x 10⁶ Zellen pro 200 µl RPMI eingestellt wurde. Nach Zugabe der ivt-mRNS (siehe Abbildungen für Mengenangaben) wurde die 200 µl Zellsuspension kurzfristig auf Eis gestellt und, unter den in Tab. 3.2 nachzulesenden Bedingungen, elektroporiert. Anschließend wurden die Zellen sofort mit dem für sie geeigneten Kulturmedium gemischt und für einige Stunden in 24- oder 6-Loch-Flachboden-Kulturplatten (Falcon bzw. TPP) bei 37°C inkubiert. Zellen, die als Negativkontrolle mit H2O statt ivt-mRNS elektroporiert worden waren, wurden in dieser Arbeit als „Kontroll-transfiziert“

bezeichnet.

Tab. 3.2: Elektroporationsbedingungen für verschiedene Zelltypen

Zellen Elektroporationsprogramm Bedingungen Zellzahl Volumen (RPMI)

3d-DZ exponentiell 300 V, 300 µF 2-3 x 10⁶ 200 µl

mLCL/LCL exponentiell 300 V, 150 µF 2-3 x 10⁶ 200 µl PHA oder

CD3/CD28-expandierte PBL

time constant 900 V; 2,3 ms 1,8-2 x 10⁶ 200 µl time constant 760 V; 2,5 ms 1,8-2 x 10⁶ 200 µl CD8⁺ T-Zellklon IVSB time constant 760 V; 2,5 ms 1,8-2 x 10⁶ 200 µl CD8⁺ T-Zellklon JB4 time constant 400 V; 2,5 ms 1,8-2 x 10⁶ 200 µl 3 Methoden

3.1.12 Peptid-Beladung von LCL

Für die Peptid-Beladung von LCL wurden jeweils zwei Millionen Zellen in 1 ml LCL-Medium in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 10 ng Peptid für zwei Stunden bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen bei 470 x g für fünf Minuten zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen in Kulturmedium resuspendiert.

3.1.13 De-novo-Induktion naiver CD8⁺ T-Zellen

Für die De-novo-Induktion naiver CD8⁺ T-Zellen wurden diese mit Antigen-beladenen mDZ oder, für den allogenen Kontrollansatz, mit H2O-elektroporierten mDZ kokultiviert. Im Falle der Antigen-beladenen mDZ wurden diese in Aliquots aufgeteilt, mit verschiedenen CrossTAg-Antigen-ivt-mRNS-Spezies (GAGE-1, MAGE-A4, NY-ESO1, SSX4, XAGE-1) transfiziert und für etwa fünf Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die mDZ zu gleichen Teilen wieder gemischt.

Zur Überprüfung der Elektorporationseffizienz wurde ein Teil der mDZ mit GFP-ivt-mRNS transfiziert. Pro Kavität einer 24-Loch-Flachboden-Kulturplatte wurden 1 x 10⁶ aufgetaute PBL mit 0,5 x 10⁶ Zellen der mDZ-Mischpopulation in 2 ml T-Zellmedium zusammengeführt. Nach zwei Tagen wurden 20 U/ml IL-2 und 5 ng/ml IL-7 dazugegeben. Im Folgenden wurden etwa alle zwei Tage 20 U/ml IL-2 und 5 ng/ml IL-7 in die Kokultur gegeben und bei Bedarf die Zellen 1:2 gesplittet.

Überschüssige mDZ-Aliquots wurden zur späteren Verwendung für die Restimulation der T-Zellen in IBIDI-Einfriermedium bei -80°C weggefroren. Nach 14 Tagen wurden die T-Zellen erneut mit aufgetauten, transfizierten mDZ-Mischpopulationen oder H2O-elektroporierten mDZ im gleichen Verhältnis wie zu Beginn restimuliert. CD8⁺ T-Zellen wurden 16 Stunden nach der Restimulation über den Aktivierungsmarker CD137 anhand des Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS Aria III, BD) isoliert und separat in 96-Loch-Platten (1 Zelle/Loch, 3 Zellen/Loch oder 6 Zellen/Loch) weiter kultiviert.

3.1.14 Kultivierung sortierter CD8⁺ T-Zellklone

Die in 96-Loch-Platten klonierten CD8⁺ T-Zellen wurden alle 14 Tage mit einem T-Zell-Stimulationsgemisches (200 µl) restimuliert. Das Stimulationsgemisch bestand aus 2 x 10³ Zellen einer Mischung unterschiedlich (CrossTAg)-Antigen-ivt-mRNS-transfizierter mLCL des DZ-Spenders (GAGE-1, MAGE-A4, NY-ESO1, SSX4, XAGE-1; bestrahlt mit 100 Gy, Bestrahlungs-anlage ¹³⁷Cs, HWM-D-2000, Gammacell) und 3 x 10⁴ Zellen einer Mischung dreier unterschied-licher PBL-Spender (bestrahlt mit 50 Gy) pro 200 μl T-Zellmedium, sowie 250 ng/ml PHA oder 3 Methoden

30 ng/ml Anti-CD3/CD28 und 20U/ml IL-2 und 20 ng/ml IL-15. Nach drei Tagen wurde das PHA-haltige Kulturmedium entfernt und durch frisches T-Zellmedium mit 20 U/ml IL-2 und 20 ng/ml IL-15 ersetzt.

3.1.15 Koinkubation von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen (APZ)

Zur Bestimmung der sezernierten Zytokinmenge nach spezifischer Stimulation, wurden T-Zellen und entsprechende APZ für die Analyse mittels ELISA kokultiviert. Zur Vermeidung unspezifischer Zytokinsekretion wurden die T-Zellen mindestens drei Tage vor der Kokultivierung ohne IL-2-Zugabe kultiviert. Außerdem wurden nur sich in der Ruhephase befindlichen T-Zellen verwendet, d.h. die T-Zellen wurden erst ab dem 10.Tag nach Stimulation für die Reaktivierung in der Kokultur eingesetzt. Hierfür wurden T-Zellen und APZ abzentrifugiert (470 x g, fünf Minuten) und anschließend in gewünschter Konzentration in T-Zellmedium resuspendiert. Die Kokultur wurde in einem Endvolumen von 200 µl in 96-Loch-Rundbodenplatten angesetzt und über Nach bei 37°C inkubiert. Nach 16 bis 24 Stunden wurden die Kulturüberstände gesammelt und in eine neue 96-Loch-Rundbodenplatte transferiert. Für eine längerfristige Lagerung wurde die Platte mit den Überständen bei -20°C aufbewahrt.

3.1.16 Kultivierung adhärenter HEK-293T-Zellen

Für die Kultivierung und Expansion von HEK-293T-Zellen wurden diese in 20 ml 293T-Zellmedium in 15 cm Zellkulturplatten (Nunc) im Brutschrank (Heraeus) bei 37°C, 5% CO2 und 95% inkubiert.

Die leicht adhärent wachsenden Zellen wurden etwa alle 3 Tage von der Oberfläche abgespült und 1:10 oder 1:20 gesplittet.

3.1.17 Transfektion von HEK-293T-Zellen

HEK-293T-Zellen wurden mit dem Plasmid pcDNA3.1MLVg/p (gag/pol-Gen des murinen Leukämievirus (Mo-MLV)) und dem Verpackungsplasmid pALF-10A1 (env-Gen des MLV-10A1) sowie dem TZRα/β-codierenden retroviralen Vektor transfiziert, um infektiöse Virushüllen zu generieren, die die gewünschten TCRα/β-Plasmid-DNS trägt (Reuß et al. 2007). Für den Polyethylenimmin-(PEI)-vermittelten Plasmid-Transfer (PEI-Transfektion) in Zellen der Linie HEK-293T wurden einen Tag zuvor 3,0 x 10⁶ Zellen in 10 cm Zellkulturplatten (Nunc) mit 10 ml 293T-3 Methoden

Zellmedium ohne Antibiotika ausgesät. Wichtig hierbei war der Verzicht auf Trypsin/EDTA, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen, da andernfalls die Zellen die Transfektion mit PEI nicht überleben. Pro Transfektion wurden 600 µl OptiMEM mit 10 ng pALF, 10 ng CeB und 10 ng TZRα oder TZRβ, 67,5 µl PEI (1x, 1 mg/µl, pH 7,0) nacheinander (Reihenfolge ist einzuhalten) gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium der 293T-Zellen wurde entfernt.

Der Transfektionsansatz wurde mit 18 ml 293T-Zellmedium (ohne Antibiotika) gemischt und am Rande der 10 cm Platte vorsichtig zu den 293T-Zellen getropft, um die Zellen nicht von der Oberfläche zu lösen. Nach 3-tägiger Inkubation bei 37°C wurde der virushaltige Überstand gesammelt und durch 0,45 µm Filter (Millipore) filtriert, um Kontaminationen mit 293T-Zellen zu vermeiden. Es wurde nur soviel wie nötig Virusüberstand von den 293T-Zellen abgenommen und das Volumen durch frisches 293T-Zellmedium ersetzt. Der filtrierte Virusüberstand wurde sofort für die erste Transduktion der PBL verwendet. Überschüssiger Virusüberstand wurde auf -20°C gelagert. Für die zweite Transduktion (Retronektin-vermittelte Infektion der PBL) wurde der restliche Überstand der 293T-Zellen abgenommen, filtriert und sofort eingesetzt.

3.1.18 Transduktion von Jurkat-76-Zellen

Für die Transduktion von Jurkat-76-Zellen mit Retroviren, die Melan-A-TZRα/β-Ketten enthielten, wurden 1 x 10⁶ Jurkat-Zellen pro Kavität einer 24-Loch-Flachboden-Kulturplatte in 2 ml filtrierten Virusüberstand (1 ml TZRα-Kette + 1 ml TZRβ-Kette tragender Virusüberstand) ausgesät. Die Zellen wurden so für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurden pro Kavität einer 6-Loch-Flachboden-Kulturplatte mit 2 ml Retronektin (12 µg/ml) in sterilem PBS für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C beschichtet. Anschließend wurde die Retronektin-PBS-Lösung entfernt und die Platte für 30 Minuten mit 2%iger BSA-Retronektin-PBS-Lösung geblockt. Nach Blockierung wurden 3 ml frisch abgenommener und filtrierter Virusüberstand (1,5 ml TZRα-Kette + 1,5 ml TZRβ-Kette Virusüberstand) auf das Retronektin-beschichtete 6-Loch gegeben und zwei Stunden bei 4°C 4000 rpm (Rotana 460R, Hettich) zentrifugiert. Danach wurden die PBL aus der 24-Lochplatte in die 6-24-Lochplatte überführt und für weitere 10 Minuten bei 32°C 2000 rpm (Rotana 460R, Hettich) zentrifugiert. Nach Zugabe von Protaminsulfat und 50 U/ml IL-2 wurden die Zellen für vier Tage bei 37°C inkubiert bevor die Jurkat-Zellen aus den 6-Lochplatten in liegende 75 cm² Kulturflaschen mit 20 ml T-Zellmedium und 50 U/ml überführt wurden. Nach weiteren drei Tagen erfolgte die Überprüfung der erfolgreichen Transduktion mit den TZRα/β-Ketten anhand des spezifischen Anti-Maus-Kette-Antikörpers, der an den murinen Teil der exogenen TZRβ-Kette band, im FACS.

3 Methoden