Zellkultur

3.3.1. Gewebekultur

(Lindl und Bauer, 1989)

Die in dieser Arbeit wurden die folgenden Zellinien verwendet:

- HEK293 (Human Embryonic Kidney; Typenbeschreibung nach der American Type Culture Collection (ATCC, 1998): CRL-1573; Graham et al., 1977).

- CHO (Chinese Hamster Ovarian; Typenbeschreibung nach der ATTC: CRL-9096

Stanley und Siminovitch, 1977).

- COS-7 (Affennierenzellen aus Cercopithecus aethiops; Typenbeschreibung nach der ATTC: CRL-1651; Gluzman, 1981).

Die Zellinien wurden in den entsprechenden Nährmedien (Zusammensetzung der zell-spezifischen Medien siehe 2.2.) in Gegenwart von 10% FCS (fetal calf serum) unter Standardbedingungen (37°C, 5% CO₂, 90% relativer Luftfeuchtigkeit) kultiviert. Dazu wurden Standard 50 ml Kulturflaschen (Fläche: 25 cm², Fa. Nunc) mit 10 ml Medium-überstand oder aber Kulturschalen (d = 90mm; Fläche: 56,7 cm²; Fa. Nunc) mit 8 ml Mediumüberstand verwendet.

3.3.1.1. Umsetzen der Zellen

Die Zellen wurden bei Erreichen einer konfluenten, zweidimensionalen Bedeckung des Zellkulturgefäßes umgesetzt (alle 3-4 Tage). Dazu wurde das überstehende Medium (konditioniertes Medium) abgesaugt, die Zellen zweimal mit PBS (frei von Ca²⁺/Mg²⁺ -Ionen) gewaschen und für 2-5 min mit Trypsin (0,25 (w/v) pro ml Kultur) behandelt.

Durch Zugabe von frischem Nährmedium wurde das Trypsin inhibiert, die Zellen durch Auf- und Abpipettieren vom Zellkulturgefäß gelöst und für 10 min bei 1000 UpM (Minfuge, Fa. Haereus) zentrifugiert. Nachdem das überstehende Medium verworfen worden war, wurde das Zellpellet in frischem Medium resuspendiert und die Zelldichte in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 10^5-6 Zellen pro 10 ml Kultur in Gegenwart von 10% konditioniertem Medium neu ausgesät.

3.3.2. Neuronenkultur

(Banker und Goslin, 1991)

3.3.2.1. Reinigung der Deckgläser

Dissoziierte Neuronen wurden auf Deckgläsern kultiviert. Als Deckgläser wurden runde Glasplättchen (d = 12 mm) verwendet. Diese wurden in einem Porzellanständer unter vorsichtigem Rühren der Reihenfolge nach 1 h in 2 M NaOH, dreimal 1 h in bidestilliertem H₂O und über 3 Tage in 70% oder 100% HNO₃ inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Deckgläser zehnmal 10 min mit bidestilliertem H₂O gewaschen, 1 h bei 60⁰C ge-trocknet und für mehrere Stunden bei 220⁰C gebacken.

3.3.2.2. Beschichtung der Deckgläser

Die Deckgläser wurden aus dem Ofen entnommen und einzeln in die Löcher einer sterilen 24-Loch-Mikrotiterplatte gelegt. Dort wurden sie mit Poly-D-Lysin (1 mg/ml in PBS, Fa.

LifeTechnologies) überschichtet und über Nacht bei 4⁰C inkubiert. Das Poly-D-Lysin wurde so abgesaugt, daß auf den Deckgläsern etwas Restflüssigkeit blieb. Anschließend

wurde zweimal 2 h mit bidestilliertem H2O gewaschen und eine zweite Beschichtung mit Laminin (10 µg/cm², Fa. LifeTechnologies) oder Fibronektin (5 µg/cm², Fa. LifeTech-nologies) durchgeführt. Am Ende wurden die Deckgläser dreimal mit PBS gewaschen und bei 4⁰C gelagert.

Etwa 1 h vor der Präparation wurde die überstehende Flüssigkeit abgesaugt, dreimal mit PBS gespült, mit Plating-Medium bedeckt und bis zum Ausplattieren der Neurone im Brutschrank bei 37⁰C vorgewärmt.

Alternativ wurden die Deckgläser zusätzlich mit Matri-Gel (Basement Membrane Matrigel^R, Fa. Boehringer Ingelheim) beschichtet.

Für das Beschichten der Deckgläser mit Matri-Gel wurden diese 20 min vor dem Ausplattieren der Neurone ebenfalls dreimal mit PBS gespült. Anschließend wurde auf ein Deckglas ein Tropfen frisch aufgetauter und kalter Matri-Gel-Lösung gegeben. Ein zweites Deckglas wurde mit der Poly-D-Lysin-beschichteten Seite auf das erste Deckglas gelegt, so daß die Matri-Gel-Lösung zwischen den beiden Deckgläsern gleichmäßig dünn verteilt wurde. Die beiden aufeinanderliegenden Deckgläser wurden wieder getrennt und in die Mikrotiterplatte überführt, die im Brutschrank bei 37⁰C gelagert wurde.

Bei der Verwendung von sterilen CELLocates (Fa. Eppendorf) anstelle von Glasplättchen wurde nur mit Laminin beschichtet. Dazu wurden die CELLocates 2 h vor Präpa-rationsbeginn dreimal mit PBS gespült, mit Laminin beschichtet und bei 37⁰C inkubiert.

Etwa 20 min vor dem Ausplattieren der Neurone wurde das überstehende Laminin abpipettiert, die Deckgläser dreimal mit Medium gespült, anschließend mit Plating-Medium bedeckt und im Brutschrank bei 37⁰C gelagert.

3.3.3. Präparation primärer hippocampaler Neurone

Diese Neuronen wurden aus dem Hippocampus der Ratte präpariert und waren embryonalen Ursprungs. Es wurden ausschließlich Wistar Ratten, die von der Tierhaltung des Universitäts-Krankenhauses-Eppendorf zur Verfügung gestellt wurden, verwendet.

Trächtige Ratten im Schwangerschaftsstadium E18 wurden mit Halothan (Fa. Hoechst) betäubt und unter vollständiger Narkose dekapitiert. Die Embryonen wurden durch Kaiserschnitt aus dem Uterus des toten Muttertieres entnommen und in eine sterile Petrischale (d = 12 cm), deren Boden mit HBSS bedeckt war, überführt.

Den Embryonen wurde der Kopf abgeschnitten, das gesamte Gehirn herauspräpariert und in HBSS getaucht. Die beiden Hirnhälften wurden getrennt und die gesamte Pia mater der Hemisphären abgezogen und verworfen. Die beiden Hippocampi wurden vorsichtig herausgeschnitten, zerkleinert und in HBSS gepufferte Trypsinlösung (0,25% (w/v)) überführt. Die Hippocampi wurden für 45 min bei 37⁰C mit der Trypsinlösung behandelt und anschließend mit HBSS gewaschen. Zur Dissoziation der Neuronen vom Gewebe wurde mit feuerpolierten Pasteuerpipetten (mit abnehmenden Spitzendurchmesser) so lange trituriert, bis keine Gewebestücke mehr erkennbar waren. Die Zelldichte dieser Zellsuspension wurde in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Mit Platingmedium wurde die gewünschte Zelldichte eingestellt und so auf die behandelten Deckgläser ausgesät, daß eine Zelldichte von 1-3x10⁵ Zellen pro cm² erreicht wurde. Das Platingmedium wurde frühestens nach 3 h oder spätestens nach 18 h gegen Nährmedium ausgetauscht.

3.3.4. Präparation primärer Neurone des peripheren Nervensystems

Es wurden die Neuronen aus den oberen Zervikalganglien (superior cervical ganglion, entsprechend auch SCG-Neuronen genannt) der Ratte präpariert Diese Neuronen des peripheren Nervensystems waren postnatalen Ursprungs und entstammten ausschließlich aus Wistar Ratten, die von der Tierhaltung des Universitäts-Krankenhauses-Eppendorf zur Verfügung gestellt wurden.

Drei Jungtiere im Alter von P15 bis P17 wurden mit Halothan betäubt und unter vollständiger Narkose dekapitiert. Die oberen Zervikalganglien, die auf der Gabelung der Halsschlagader lokalisiert sind, wurden herausgeschnitten und in L-15-Medium getaucht.

Diese wurden von Geweberesten befreit. Die Ganglien besitzen eine feine Extrahaut, die durch vorsichtiges Zupfen mit einer spitzen Pinzette entfernt wurde. Die nackten Zervikalganglien wurden jeweils in vier gleich große Stücke geschnitten und zweimal mit HBSS-Puffer gewaschen. Die Ganglienstücke wurden nacheinander für 15 min bei 37⁰C mit Kollagenase-Lösung (400 U/ml HBSS-Puffer) behandelt, zweimal mit HBSS-Puffer gewaschen und für weitere 30 min bei 37⁰C mit Trypsin-Lösung (1% (w/v) in HBSS-Puffer) behandelt. Anschließend wurden die enzymbehandelten Ganglienstücke in 2 ml Nährmedium überführt und durch Trituieren mit feuerpolierten Pasteurpipetten (mit abnehmenden Spitzendurchmesser) dissoziiert. Durch Zentrifugieren bei 2000 UpM

(Minifuge, Fa. Haereus) für 2 min wurden die freigesetzten Neurone sedimentiert. Der Überstand wurde weitestgehend abgenommen und die sedimentierten Neurone in 1 ml Nährmedium resuspendiert. Dichte und Zustand dieser Zellsuspension wurde mikroskopisch analysiert. Ein Tropfen dieser Zellsuspension wurde zentral auf die beschichteten Deckgläser (oder CELLocates) pipettiert. Die Kulturen wurden für 3 h unter Standardbedingungen (37⁰C, 5% CO2, 95% relative Luftfeuchtigkeit) kultiviert, bis 2 ml frisches Nährmedium zugeführt wurde. Aus den sechs oberen Zervikalganglien der drei Jungtiere wurden in der Regel zehn primäre SCG-Kulturen hergestellt.

3.3.5. Kultivierung der primären Neuronenkulturen

Die hippocampalen und SCG-Neuronen wurden bei 37⁰C, 5% CO₂ und 95% relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert. Nach 3 Tagen in Kultur wurde der erste Mediumwechsel durchgeführt. Dabei wurden zwei Drittel des Mediumüberstandes gegen frisches, auf 37⁰C vorgewärmtes Nährmedium ausgetauscht. Weitere Mediumwechsel wurden alle 5-6 Tage durchgeführt.

Zur Unterdrückung des Wachstums von nicht neuronalen Zellen (Gliazellen und Fibroblasten) wurde in Kulturen, die länger als 8 Tage kultiviert werden sollten, beim ersten und bei jedem zweiten Mediumwechsel 1 bis 1,5 µM Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (Ara-C) dem Nährmedium zugesetzt.

In einzelnen Versuchen wurde neben der Beschichtung der Deckgläser mit Matri-Gel auch die Applikation von Matri-Gel als Mediumzusatz durchgeführt. Dazu wurden 75 µg frisch aufgetautes Matri-Gel pro ml Medium in der Kälte im Nährmedium gelöst, anschließend auf 37⁰C erwärmt und direkt eingesetzt. Matri-Gel als Mediumzusatz wurde in diesen Versuchen beim ersten und bei jedem zweiten Mediumwechsel angewendet.

3.3.6. Vitalitätstest an primärkultivierten Neuronen (Petroski und Geller, 1994)

Als Vitalitätsmarker wurden dem Medium der zu untersuchenden Primärkultur 10 µM 5(6)-Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA, Fa. Sigma) zugesetzt und die Kulturen für 15 min bei 37⁰C weiter kultiviert. CFDA ist ein membranpermeables und nicht

fluoreszierendes Molekül. In vitalen Neuronen wird das Molekül durch zytosolische Esterasen in das fluoreszierende Anion 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) hydrolysiert. Die Primärkulturen wurden anschließend zweimal für 20 min bei 37⁰C mit HBSS-Puffer gewaschen. Dabei wurde das nicht membranpermeable und fluoreszierende CF aus den Gliazellen gewaschen, während es in Neuronen nach wie vor nachweisbar war. Der Fluoreszenznachweis wurde entweder in fixierten Zellen (siehe 3.5.1.) oder in vivo durch Fluoreszenzmikroskopie (siehe 3.6.) durchgeführt.