Zellkultur

2.7.2 Verwendete Zellen

Zellen/ Zelllinie Beschreibung Referenz Medium

A293 Humane, embryonale Nierenepithelzellen, durch Adenovirus 5 DNA transformiert

Graham et al.

(1977), ATTC CRL-1573

1

HUVEC Primärkultur von Endothelzellen aus humaner Nabelschnurvene

Jaffe et al.

(1973);

Thornton et al., (1983)

4 + siehe 2.7.5

HUE s p o n t a n i m m o r t a l i s i e r t e h u m a n e Endothelzellen

ATCC 3

BFS-1 Durch Methylcholanthrene A Transformation hergestellte Maus-Fibrosarkomzellen

Hafner et al.

(1996)

2

2.7.3 Kultivierung von eukaryotischen Zellen

Eukaryotische Zellen wurden in entsprechenden Wachstumsmedien in einer wassergesättigten Atmosphäre und 5-7% CO₂ bei 37°C kultiviert. Bei Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen zweimal mit PBS, pH 7,4 gewaschen und mit 1 ml Trypsin/EDTA-Lösung pro 75 cm² inkubiert, bis sie sich von der Gewebekulturflasche ablösten und vereinzelten. Die Zellen wurden anschließend in 10 ml Medium aufgenommen, durch Zentrifugation (250 x g, 5 min, RT) sedimentiert und in frischem Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in einer 1/3 bis 1/10 Verdünnung (je nach Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen) in neue Gewebekulturflaschen ausgesät.

2.7.4 Langzeitlagerung von eukaryotischen Zellen

Die Langzeitlagerung von eukaryotischen Zellen erfolgte in der Gasphase über flüssigem Stickstoff. Hierzu wurden die Zellen wie im vorigen Abschnitt beschrieben von der Gewebekulturflasche abgelöst und abzentrifugiert. Das Sediment wurde in Wachstumsmediummit 8% (v/v) Dimethylsulfoxid (Merck, Darmstadt) und 42% (v/v) FCS resuspendiert, in Kryoröhrchen (Greiner, Solingen) überführt und über Nacht bei -80°C eingefroren. Am nächsten Morgen wurden sie in einen Tank mit flüssigem Stickstoff eingelagert. Zur erneuten Kultivierung wurden die Kryoröhrchen in einem Wasserbad bei 37°C möglichst schnell aufgetaut, die Zellsuspension in 10 ml vorgewärmtem Wachstumsmedium aufgenommen und für 5 min bei 250 x g zentrifugiert. Das Sediment wurde in frischem Medium resuspendiert und die Zellen in einer 25 cm² Gewebekulturflasche ausgesät. Am darauffolgenden Tag wurde das Medium noch einmal gewechselt.

2.7.5 Isolation und Kultur von Endothelzellen der humanen Nabelschnurvene (HUVEC)

(Jaffe et al., 1973; Thornton et al., 1983)

Für die Präparation der Endothelzellen wurden grundsätzlich sterile Lösungen und Instrumente sowie humane Nabelschnüre verwendet, die nach der Geburt maximal zwei Tage bei 4°C gelagert wurden. Die Nabelschnur wurde äußerlich mit PBS von Blutresten gereinigt und die Nabelschnurvene mit 50 ml PBS gespült (Knopfkanüle).

Nach einer erneuten Spülung der Vene mit 5 bis 10 ml Kollagenase-Lösung wurde das untere Ende der Nabelschnur mit einer Aderklemme verschlossen, und die Vene mit Kollagenase-Lösung gefüllt, bis eine deutlich sichtbare Aderdehnung auftrat.

Anschließend wurde auch das obere Ende der Vene mit einer Aderklemme verschlossen. Die mit Kollagenase-Lösung gefüllte Nabelschnur wurde für 20 min bei 37°C inkubiert, die Endothelzellen durch leichte Massage der Nabelschnur in Suspension gebracht und das Zellgemisch in ein Falcon-Reaktionsgefäß, welches 3 ml

FCS enthielt, überführt. Nach Zentrifugation für 5 min bei 250 x g wurde das Zellsediment in 4 ml Wachstumsmedium resuspendiert und auf eine gelatinisierte Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 6 cm ausgesät (Passage 0). Eventuell kontaminierende Blutzellen wurden nach 2 Tagen durch Waschen des Zellrasens mit PBS entfernt.

Die Kultur der HUVEC erfolgte auf gelatinisierten Schalen in Wachstumsmedium bei 37°C und 5% CO₂ in wasserdampfgesättigter Atmosphäre. Nach Erreichen der Zellkonfluenz wurden die HUVEC mit 2x 5 ml PBS/ 75 cm² Kulturfläche gewaschen, in 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung vom Flaschenboden bei 37°C abgelöst und in 10 ml Wachstumsmedium resuspendiert. Die Endothelzellen wurden bei 250 x g durch Zentrifugation sedimentiert (5 min), erneut in Wachstumsmedium resuspendiert und in einem Verhältnis von 1/3 (Zellen/ cm² Kulturfläche) auf gelatinisierte Zellkulturschalen ausgesät. In den in dieser Arbeit geschilderten Experimenten wurden HUVEC der Passagen 1 bis 4 verwendet.

Kollagenase-Lösung: 0,03% (w/v) Kollagenase in PBS (CLS3, 180 U/mg, Chargen Nr. 43D684, PAN Systems, Aidenbach) aliquotieren und bei -20 °C aufbewahren

HUVEC-Medium: MCDB131 (CC Pro, Neustadt) 10% (v/v) FCS (PAA, Cölbe)

1% (v/v) Penizillin/Streptomyzin (PAA, Cölbe) 1% (v/v) Amphotericin B (PAN Systems, Aidenbach) 2 mM Glutamin (PAA, Cölbe)

10 µg/ml Heparin (Sigma, St. Louis, USA) 1 Einheit "Endothelial Cell Growth Supplement"

(Promocell, Heidelberg)

2.7.6 Gelatinisierung von Zellkulturschalen

Der Boden der Zellkulturschale wurde mit 1% (w/v) Gelatinelösung bedeckt, und die Schale für 20 min bei 37°C inkubiert. Die Gelatinelösung wurde abgesaugt und die beschichtete Schale sofort verwendet.

2.7.7 Transfektion eukaryotischer Zellen mittels Liposomen

Zur Transfektion von Zellen wurde das Superfect Reagenz (Qiagen, Hilden) nach Vorschriften des Herstellers verwendet. Dabei handelt es sich um positiv geladene Liposomen, die mit DNA Komplexe bilden. Werden Zellen mit diesen Komplexen inkubiert, kann die DNA von den Zellen aufgenommen werden. Entsprechend der Anzahl der zu transfizierenden Zellen, wurde eine bestimmte DNA Menge mit dem Superfect Reagenz und Medium (ohne Zusätze) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit dem DNA-Liposomen-Komplex für 2-3 h im Brutschrank bei 37°C und inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit neuem Wachstumsmedium für 24-48 h im Brutschrank belassen. Danach wurden weitere Experimente wie Immunfluoreszenzfärbung (siehe 2.7.10) oder Luziferase-Reportergen-Analyse (siehe 2.7.8) durchgeführt.

2.7.8 Luziferase-Reportergen-Analyse

Dabei wurden DNA Konstrukte verwendet, bei denen die Expression des Luziferase Reportergens von verschiedenen Promotoren reguliert wurde. Durch Co-Expression von Transkriptionsfaktoren konnte deren Einfluss auf die Promotoraktivität untersucht werden. Die Expression des Reportergens diente als Maß für die Aktivität der genregulatorischen Elemente, unter deren Kontrolle es exprimiert wurde. Da Transfektionseffizienzen gewöhnlich Schwankungen unterliegen, wurde zusammen mit dem Luziferase-Reporterkonstrukt auch ein zweites Reportergenkonstrukt mit konstitutiv aktivem Promotor und dem lacZ-Gen (CMV-LacZ) transfiziert, dessen

Aktivität zur Normalisierung verwendet wurde. Für die vom Luziferase- sowie vom lacZ-Gen kodierten Enzyme gab es spezifische chemilumineszente Analysesysteme, die die Quantifizierung der Enzyme in Zellextrakten erlaubten. 24-48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und für die luminometrische Analyse aufgearbeitet. Dabei wurde der Dual Light Kit (Tropix, Bedford, USA) nach den Angaben des Herstellers verwendet. Die Luziferase- und LacZ-Aktivitäten wurden nacheinander im Luminometer gemessen und der Quotient der erhaltenen relativen Licht-Einheiten (RLU) gebildet. Innerhalb eines Reporter-Experiments wurden die Werte in Triplikaten gemessen und der Mittelwert bestimmt. Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms InStat 2.01 (T-Test für unverbundene Stichproben).

In einem typischen Experiment wurden je 1 µg Luziferase Reporterplasmid, 0,5 µg β -Galaktosidase Reporter und je 1 µg Expressionsplasmide von Transkriptionsfaktoren co-transfiziert. Es wurde pcDNA3 Vektor co-transfiziert, um in jedem Ansatz identische DNA Mengen zu erhalten. Die DNA wurde mit 100 µl Medium (ohne Serum oder Zusätze) und 10 µl Superfect (Qiagen, Hilden) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mixtur wurde dann auf ca. 70% konfluente A293 oder HUE Zellen in 6-Loch-Kulturplatten gegeben und für 3 h bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in Wachstumsmedium weiter kultiviert. 24-48 h nach der Transfektion wurden die Zellen in Lyse-Puffer geerntet (Dual Light Kit), 10 min bei 11000 rpm sedimentiert (Tischzentrifuge) und 5 µl des Überstandes für die luminometrische Messung von Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivität eingesetzt.

Jedes Experiment wurde mindestens dreifach durchgeführt.

2.7.9 Nachweis der ββββ-Galaktosidase-Aktivität in transfizierten Zellen

Der Nachweis der β-Galaktosidase-Aktivität in transfizierten Zellen diente in dieser Arbeit zur Kontrolle der Expression verschiedener LacZ-Reportergenkonstrukte in vitro. Dazu wurden die Zellen 48 h nach der Transfektion für 10 min bei

Raumtemperatur in 1% (v/v) Glutaraldehyd/ PBS fixiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit Färbelösung für 90 min bei 37°C inkubiert.

Nach Absaugen der Färbelösung wurde die Farbentwicklung durch Waschen der Zellen mit 20 mM EDTA/ PBS gestoppt.

Färbelösung: 3 mM K₃Fe(CN)₆ 3 mM K₄Fe(CN)₆ 1 mM MgCl₂ 0,1% Triton X100

0,5% (w/v) X-Gal (MBI Fermentas, St. Leon-Rot)/

Dimethylformamid

in 0,1 M Natriumphosphatpuffer/10 mM KCl pH 7,5

2.7.10 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen

Sterile Deckgläser (22 mm x 22 mm) wurden auf den Boden von 6-Loch Kulturplatten gelegt und darauf HUE Zellen ausgesät. Die Zellen wurden transient transfiziert (siehe 2.7.7) und danach 24-48 h weiter kultiviert. Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und für 20 min bei Raumtemperatur mit 3% (w/v) Paraformaldehydlösung fixiert. Die Zellen wurden zweimal 5 min in PBS gewaschen, zur Permeabilisierung für 10 min mit 0,2% (v/v) Triton X-100/ PBS inkubiert und erneut zweimal 5 min mit PBS gewaschen. Es folgte eine 20 min Inkubation mit 3%

(w/v) BSA-Lösung, bevor der 1. Antikörper auf die Zellen gegeben wurde. Der anti-FLAG M2 Antikörper (Sigma, St. Louis, USA) wurde 1:500 in 0,5% (w/v) BSA/ 0,5%

(v/v) Tween20/ PBS verdünnt und die Zellen damit für 90 min inkubiert. Dann wurde dreimal mit PBS gewaschen und als Zweitantikörper der Ziege-anti-Maus-Alexa594 Antikörper (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) in einer Verdünnung von 1:2000 für 1 h im dunkeln auf die Zellen gegeben. Anschließend wurden die Zellen für 10 min mit Hoechst 33258 (Sigma, Deisenhofen) inkubiert (1:2000), um die Zellkerne zu

färben. Nach dreimal Waschen mit PBS wurden die Deckgläser kurz in ddH₂O eingetaucht und mit Mowiol auf einen Objektträger eingedeckelt (siehe 2.6.5). Die Auswertung erfolgte am Fluoreszenzmikroskop.