Zellkultur

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MATERIAL UND METHODEN 45 Wurden C26-Zellen für Tumorinduktionen oder Kokultur zur Antigenbeladung der für die Vakzinierung generierten DC geerntet, wurde der Zellrasen nicht enzymatisch mit Trypsin, sondern mechanisch mit einem Zellschaber vom Flaschenboden entfernt.

Auch dieser Prozedur folgten die oben beschriebene Vereinzelung der Zellen mit wiederholtem Ausspritzen durch eine Kanüle (20 G), Zentrifugation sowie Resuspension in 10 ml HBSS und Zählung zur Bestimmung der Gesamtzellzahl. Für Tumorinduktionen wurde die Konzentration der Suspension auf 1 x 10⁶ C26-Zellen/ml eingestellt.

4.2.3 Dendritische Zellen

4.2.3.1 DC-Generierung aus murinem Knochenmark

Mit geringen Modifikationen erfolgte die Generierung muriner DC für die Vakzinierungen im Rahmen der Tumortherapieexperimente wie in der Literatur beschrieben [Inaba, 1992; Brunner 2000]. Acht Tage vor jeder Therapie wurden zwei weiblichen Balb/c-Mäusen im Alter von sechs bis zwölf Wochen Femur- und Tibia-Knochen beider Hinterläufe entnommen und die darin enthaltenen, mononukleären Knochenmarkzellen gewonnen. Nach Zählung der Ausbeute wurde die Konzentration der Suspension auf 1 x 10⁷ Zellen/ml eingestellt und folgende, unkonjugierte Ratte-Anti-Maus-Antikörper in unten angegebener Menge zugegeben, um Monozyten und Granulozyten sowie B- und T-Lymphozyten zu markieren:

Antikörper Anteil (in %) Antikörpermenge/10⁷ Zellen

Anti-Ly6G/C (Gr-1) 40 12 µg

Anti-CD45R/B220 30 9 µg

Anti-MHC-II 10 3 µg

Anti-CD4 10 3 µg

Anti-CD8a 10 3 µg

Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen gewaschen und in 10 ml DC-Medium resuspendiert. Anschließend wurden pro 1 x 10⁷ Knochenmarkzellen mindestens 4 x 10⁷ sogenannte DynaBeads^® zugegeben und die Suspension erneut für 30 Minuten bei 6 °C unter ständigem Schwenken inkubiert. Bei DynaBeads^® handelt es sich um Antikörper-gekoppelte, uniforme Polymerkügelchen mit einem Durchmesser von 4,5 µm, in die ferromagnetisches Material (Fe2O3 und Fe3O4) eingebettet ist. Die bei der hier beschriebenen DC-Gewinnung eingesetzten DynaBeads^® waren mit spezifisch gegen die Fc-Regionen sämtlicher IgG-Subklassen der Ratte gerichteten

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Schaf-Antikörpern gekoppelt, wodurch sich Bindungen zwischen den Zell-gebundenen, primären Antikörpern und den DynaBeads^®-gekoppelten, sekundären Anti-IgG-Antikörpern ausbildeten. Nach erfolgreicher Inkubation, einem erneuten Waschschritt und Resuspension in 2 ml DC-Medium konnten die Zellen durch jeweils 2-minütiges Einbringen in das starke Magnetfeld des sogenannten Dynal MPC-1^® (magnetic particle concentrator) in markierte und unmarkierte Zellen aufgetrennt werden.

Während die markierten Zellen an der dem Magnetfeld zugewandten Seite des Probenröhrchens haften blieben, konnten die in Suspension verbliebenen, unmarkierten Zellen nach dem Prinzip der negativen Selektion oder Depletion abgesaugt und in ein neues Röhrchen überführt werden. Im Anschluss erfolgten Resuspension der DynaBeads^®-markierten, abgesetzten Zellen in 2 ml DC-Medium und erneutes Einbringen in das Magnetfeld des Dynal MPC-1^®. Zur Optimierung der Ausbeute an unmarkierten Zellen wurde dieser Vorgang insgesamt zweimal wiederholt.

Die während der verschiedenen Schritte in Suspension verbliebenen Zellen wurden gepoolt. Im letzten Schritt wurden die gepoolten Überstände noch einmal im Dynal MPC-1^® aufgereinigt, der Überstand in ein frisches Röhrchen überführt und die Zellzahl bestimmt. Nach auf diese Weise durchgeführter, magnetischer Separation verblieben rund 15 bis 20 % der Ausgangszellzahl –wie gewünscht hauptsächlich myeloische Vorläuferzellen– für die Weiterkultivierung.

Die Zellen wurden in einer Konzentration von 0,55 x 10⁶ Zellen/ml DC-Medium in mittelgroßen Kulturflaschen ausgesäht. Zur Optimierung der Entwicklung von unreifen DC aus myeloischen Vorläuferzellen wurde dem Kulturmedium GM-CSF (200 U/ml) und IL-4 (20 ng/ml) zugesetzt [Brunner 2000].

Nach drei Tagen in Kultur wurde das Mediumvolumen durch erneute Zugabe von GM-CSF- und IL-4-supplementiertem DC-Medium verdoppelt, um während der gesamten Kulturdauer ein optimales Angebot an Nährstoffen und Wachstumsfaktoren zu garantieren.

4.2.3.2 Antigenbeladung und Aktivierung der generierten, unreifen DC in vitro

Am sechsten Tag der Kultur mit GM-CSF und IL-4 wurden die aus den myeloischen Progenitorzellen differenzierten, unreifen DC geerntet. Durch ihre rundliche Form, noch ohne für reife DC typische Dendriten, waren die nur leicht adhärent wachsenden Zellen

MATERIAL UND METHODEN 47 lichtmikroskopisch gut von ebenfalls in der Kultur vorkommenden, stärker adhärenten und häufig irregulär geformten, monozytären Zellen zu unterscheiden. Nach der Überführung des abgesaugten Überstands an Kulturmedium in ein 50 ml-Röhrchen wurden die Zellen am Boden der Kulturflasche mit 3 ml eiskaltem PBS bedeckt für einige Minuten bei 37 °C inkubiert. Danach waren die DC durch mehrmaliges Spülen über den Flaschenboden mit PBS in der Regel gut ablösbar und wurden mit dem Mediumüberstand gepoolt. Waren bei der anschließenden, lichtmikroskopischen Kontrolle noch viele DC am Flaschenboden adhärent, wurde der Vorgang so lange wiederholt bis möglichst alle DC abgelöst waren. Es folgten Zentrifugation (370 x g, 7 Min, 4 °C), Resuspension der Zellen in 10 ml DC-Medium und Zählung zur Bestimmung der Gesamtzellzahl.

Zur Antigenbeladung wurden der geernteten DC-Suspension C26-Zellen, die in einer Röntgenbestrahlungsanlage (Institut für Immunologie, LMU München, D) mit 100 Gray bestrahlt worden waren, im Verhältnis 1:6 zugemischt. Diese Strahlendosis führte zu Inaktivierung und Teilungsunfähigkeit der Tumorzellen, jedoch nicht zu ihrer Lyse. Die aus murinem Knochenmark generierten, unreifen DC zeigten zum Zeitpunkt der Kokultur durch die vorausgegangene, sechstägige Kultur in GM-CSF-haltigem Medium eine hohe MHC-II-Expression als Voraussetzung für eine effiziente Antigenpräsentation. Die Mischkultur wurde auf eine Konzentration von 1 x 10⁶ DC/ml eingestellt und in GM-CSF- und IL-4-supplementiertem DC-Medium weiterkultiviert.

24 Stunden später wurde der Kokultur der TLR9-Ligand CpG 1826 (CpG 6 µg/ml) zugegeben und die beladenen DC so für weitere 24 Stunden aktiviert.

4.2.3.3 Ernte Antigen-beladener, aktivierter DC zur Immunisierung in vivo

Am neunten Tag nach Gewinnung der myeloischen Vorläuferzellen erfolgte die Ernte der nun vollständig ausgereiften DC. Um FCS-Rückstände zu entfernen, wurde der Zellrasen nach Absaugen des Mediumüberstands zunächst zweimal mit serumfreiem HBSS gewaschen. Danach wurden die nur leicht adhärenten DC vorsichtig mit HBSS vom Boden der Kulturflasche abgespült, um Verunreinigungen durch stärker haftende C26-Zellen zu vermeiden, abzentrifugiert (370 x g, 7 Min, 4 °C), gezählt und in HBSS auf eine Konzentration von 1 x 10⁶-Zellen/ml eingestellt. Unmittelbar vor der Applikation

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in vivo wurde den Antigen-beladenen, reifen DC noch 500 µg/ml CpG 1826 als in vivo wirkendes Adjuvans beigemischt.

In der folgenden Abbildung sind die einzelnen Schritte bei der Generierung der eingesetzten DC-Vakzine schematisch dargestellt (Abb. 4.1).

Abb. 4.1: Generierung der zur Immuntherapie muriner C26-Tumore eingesetzten DC-Vakzine.

Nach Generierung unreifer DC aus syngenen Knochenmarkvorläuferzellen durch sechstägige Inkubation mit Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) und Interleukin-4 (IL-4) werden die DC über 24 Stunden mit bestrahlten C26-Zellen koinkubiert und anschließend mit CpG 1826 weitere 24 Stunden lang aktiviert. Die Kokultur der DC mit teilungsinaktivierten Tumorzellen ermöglicht die Aufnahme von Tumorantigenen aus C26-Zellen, die die DC nach ihrer Reifung und Aktivierung über MHC-II-Komplexe in Verbindung mit kostimulatorischen Molekülen (B7) stabil präsentieren.