Zellkultur

Die Arbeiten mit den Zellkulturen fanden ausschließlich unter sterilen Bedingungen an Laminar-Flow-Sicherheitswerkbänken statt. Die Zellen wurden in einem Inkubator / Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 in gesättigter Wasserdampfatmosphäre kultiviert.

Permanente Zelllinien wurden regelmäßig auf Kontaminationen mit Mycoplasmen mittels PCR entsprechend der Angabe der Hersteller (VenorGeM, Minerva Biolabs) untersucht und waren stets Mycoplasma-negativ.

2.2.1.1 THP-1

Bei den Zellen der Linie THP-1 handelt es sich um humane Monozyten, die ursprünglich aus dem Blut eines Patienten mit akuter monozytischer Leukämie isoliert worden sind.

THP-1-Zellen besitzen Monozyteneigenschaften wie die Fähigkeit zur Phagozytose, Esterase-Aktivität und Produktion von Lysozymen (Tsuchiya et al. 1980) und wurden in Nährmedium als Suspensionskultur gehalten. Bei Stimulation durch den Phorboldiester PMA (mit 20 mM, soweit nicht anders erwähnt) adhärierten die Zellen jedoch und differenzierten zu reifen Makrophagen, die vergleichbare Merkmale wie primäre Monozyten (2.2.1.2) aufwiesen (Tsuchiya et al. 1982).

Für die Kultur der THP-1-Zellen wurde RPMI-1640-Medium mit 10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 1 mM Na-Pyruvat, 10 mM HEPES und 2,5 g/l Gluko-se angereichert. Die Monozyten wurden zweimal pro Woche im Verhältnis 1:2 mit fri-schem Medium gemischt und im Brutschrank inkubiert.

2.2.1.2 PBMC-Monozyten

Primäre humane Monozyten wurden aus dem Blut von Blutspendern des Instituts für Transfusionsmedizin, Göttingen gewonnen. Die Verwendung humanen Probenmaterials für das vorliegende Projekt erfolgte gemäß der vorliegenden Genehmigung (Nr. 28/3/08) durch die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen. Die Monozyten wurden aus den mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von Buffy Coats isoliert. Vor der Isolation der Zellen wurde von jedem Buffy Coat zunächst ca. 0,5 ml Blutplasma durch Zentrifugation gewonnen, das zum Nachweis von Toxoplasma-spezifischem IgG und IgM verwendet wurde (2.2.1.6). Toxoplasma-positive Blutspender konnten so von nicht-infizierten unterschieden werden (3.3).

2 Material und Methoden

Zur Gewinnung der PBMC wurden die Zellen des Buffy Coats mittels Dichte-gradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque® abhängig von ihrer Dichte in verschiedene Fraktionen aufgetrennt (Fuss et al. 2009). Somit konnten Monozyten zusammen mit anderen mononukleären Zellen von Blutplasma und Erythrozyten separiert werden. Hierzu wurde die Buffy-Coat-Blutspende mit einem Verdünnungsmedium aus RPMI 1640, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin im Verhältnis 1:2 aufgefüllt und vorsich-tig in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen auf eine 15-ml-Ficoll-Paque®-Schicht gefüllt. Dabei wurde darauf geachtet, dass sich beide Phasen nicht vermischten. Anschließend wurde für 30 min bei 900 x g mit geringer Beschleunigung und Abbremsung (Stufe 2) zentrifugiert.

Aufgrund der verschiedenen Dichten der Blutbestandteile ergab sich dadurch eine unter-schiedlich starke Migration und somit eine klar differenzierte Fraktionierung der flüssigen und korpuskulären Anteile (Abb. 2.1).

Abb. 2.1 Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque® Plus

Aufgrund verschiedener Dichten und Sedimentationskonstanten lagerten sich die Blutzelltypen nach Zentrifugation in unterschiedlichen Schichten im 50-ml-Falcon-Röhrchen an. Nach Entfernen der zu oberst liegenden Plasma-Phase wurde die Phase der mononukleären Zellen (PBMC) vorsichtig isoliert und weiter aufgereinigt.

Die mononukleären Zellen (PBMC) des Buffy Coat wurden vorsichtig aus der Interphase isoliert und zweimal für 10 min bei 400 x g in Verdünnungsmedium gewaschen; abschlie-ßend erfolgte eine Zellzahlbestimmung.

2 Material und Methoden

Mit dem Ziel, nur die primären Monozyten zu erhalten, wurden nun alle gewonnenen mononukleären Zellen (PBMC) in 12 ml Verdünnungsmedium resuspendiert, in Zell-kulturschalen ausgesät und für 2 h inkubiert. Da Monozyten im Gegensatz zu anderen PBMC-Zellen an der Oberfläche von Zellkulturschalen aus Plastik adhärieren (Lenzner et al. 1998), konnten sie danach zweimal vorsichtig mit 10 ml PBMC-Medium (RPMI 1640, 10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin) gespült und von anderen, nicht adhärenten Zellen gereinigt werden. Für spätere Infektionsversuche wurden die Zellkulturschalen mit 12 ml PBMC-Medium aufgefüllt.

2.2.1.3 L929-Fibroblasten

Für die Kultivierung von T. gondii wurden adhärente, murine Fibroblasten der Zelllinie L929 als Wirtszellen verwendet. Die Zellen wurden in 6-Loch-Platten in DMEM-Medium mit 1% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 1 mM Na-Pyruvat und 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) kultiviert. Zweimal pro Woche wurden die Fibroblasten vom Boden der Zellkulturplatten mit einem Zellschaber abgekratzt und in Medium resuspendiert. In jede Vertiefung einer neuen 6-Loch-Platte wurden ca. 7 Tropfen der Zellsuspension mit etwa 4 ml frischem Medium gemischt und inkubiert. Die übrige Zellsuspension wurde für die Kokultur mit Toxoplasmen verwendet (siehe unten).

2.2.1.4 Toxoplasma gondii

Die vorliegenden Versuche wurden mit T. gondii-Tachyzoiten des Maus-avirulenten Stammes NTE durchgeführt (Gross et al. 1991). Die Tachyzoiten wurden in murinen L929-Fibroblasten als Wirtszellen vermehrt und für Infektionsversuche von den Fibro-blasten wieder getrennt.

Zur Kultivierung wurden in verschiedenen Mischungsverhältnissen L929-Zellsuspension (siehe oben) und Toxoplasmen-Suspension in eine 12-Loch-Platte getropft und in fri-schem RPMI-1640-Medium mit 1% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 100 U/ml Penicillin sowie 100 µg/ml Streptomycin kultiviert. Hatten die Toxoplasmen den überwiegenden Teil der Wirtszellen lysiert, waren großteils vital und wiesen ihre typische bogenförmige Gestalt auf, wurden sie zweimal pro Woche in L929-Fibroblasten subkultiviert.

2 Material und Methoden 2.2.1.5 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Für das Einfrieren der THP-1-Zellen befanden sich die Monozyten in ihrer exponentiellen Wachstumsphase und wiesen eine hohe Vitalität auf. Die Zellen wurden aus der Zellkul-turflasche isoliert, mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer gezählt und auf eine Dichte von 1x10⁷ Zellen pro ml eingestellt. In Kryoröhrchen wurde ein Teil Zellsuspension mit einem Teil Einfriermedium aus 40% des THP-1-Zellkulturmediums, 40% hitzeinaktiviertem FCS und 20% Dimethylsulfoxid (DMSO) gemischt und sofort im Styropor-Block bei -80°C tiefgefroren. Für die dauerhafte Lagerung wurden die Kryoröhrchen am nächsten Tag in flüssigen Stickstoff überführt.

Da das im Einfriermedium enthaltene DMSO im flüssigen Zustand den Zellstoffwechsel stark schädigen kann, mussten die Zellen sehr schnell aufgetaut werden. Hierzu wurden die Kryoröhrchen zuerst mit 70%igem Ethanol desinfiziert und danach in einem Wasser-bad (37°C) angetaut, bis sich der Inhalt von der Röhrchenwand löste. Unter der Sterilbank wurden die Röhrchen erneut mit Ethanol desinfiziert und der Inhalt in vorbereitete 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 40 ml Zellkulturmedium überführt. Die Zellsuspension wurde mit 400 x g für 5 min zentrifugiert, das Pellet in frischem Zellkulturmedium resuspendiert und in einer Zellkulturflasche ausgesät.

2.2.1.6 Serologischer Nachweis von T. gondii

Vor der Isolation von PBMC-Monozyten aus Buffy Coats von Blutspendern (2.2.1.2) wurden Plasma-Proben entnommen und mittels indirekten Immunfluoreszenztests bzw.

ELISA (beide bioMérieux) auf Toxoplasma-spezifische Antikörper untersucht. Fiel einer der Tests positiv aus, wurden Immunglobuline (Ig) der Gruppe M, G und A mittels ELISA genauer differenziert, sowie in Immunoblots (eigene Herstellung) bestätigt. Die serologi-schen Analysen haben ergeben, dass 4 der 12 untersuchten Proben Toxoplasma-positiv waren (3.3, Tabelle 3.1).