Zellkultur von eukaryotischen Zellen

44 wird das Virusinokulum abgesaugt und die Zellen werden mit entsprechendem Zellkulturme-dium versetzt. Nach einer bestimmten Infektionszeit (in dieser Arbeit 2, 4, 8, 16/18 oder 24 h) werden die Zellen für die weitere Analyse vorbereitet.

Methoden

45 einer 1:10-Mischung aus DMSO und Zellkulturmedium aufgenommen. Jeweils 1 ml der Zellsus-pension wird in ein gekühltes Kryoröhrchen gegeben und in einer gekühlten (-20 °C), mit Iso-propanol gefüllten Einfrierbox über Nacht langsam bei -80 °C abgekühlt. Im Anschluss erfolgt der Transfer in die Gasphase oberhalb flüssigen Stickstoffs.

Um die Zelllinien zu rekultivieren, werden die tiefgefrorenen Zellen bei 37 °C aufgetaut. Die Zell-suspension wird in 4 ml vorgewärmtes Zellkulturmedium aufgenommen und in eine 25 cm² -Zellkulturflasche überführt. Am nächsten Tag werden die angewachsenen Zellen wie in 6.2.1 beschrieben weiterkultiviert.

6.2.3 Transiente Transfektion von eukaryotischen Zellen

6.2.3.1 Transfektion von DNA-Plasmiden

In dieser Arbeit erfolgte die Transfektion von DNA-Plasmiden zunächst mit dem Nanofectin Kit von PAA und, als dieses nicht mehr erhältlich war, mit dem TransIT-LT1-Reagenz von Mirus Bio LLC.

Je nach Versuchsansatz werden die zu verwendenden Zellen normal oder revers transfiziert. Bei der normalen Transfektion werden Zellen in Wells von 12-Well-Zellkulturplatten so ausgesät, dass sie am Tag der Transfektion 60 % konfluent sind. Bei einer reversen Transfektion wird das Transfektionsreagenz zuerst in ein Well einer 12-Well-Zellkulturplatte vorgelegt und erst darauf werden die auszusäenden Zellen in einer Konzentration gegeben, dass sie am nächsten Tag zu 60 % konfluent sind.

Transfektion mit Nanofectin:

Für einen einzelnen Transfektionsansatz mit Nanofectin wird 0,5 µg DNA in einem Reaktionsge-fäß mit 50 µl Opti-MEM gemischt, kurz gevortext und mit einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Um das vom Hersteller angegebene optimale DNA-Nanofectin-Verhältnis zu verwenden, werden in einem weiteren Reaktionsgefäß 1,6 µl Nanofectin mit 50 µl Opti-MEM vermischt, ebenfalls kurz gevortext und mit einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Dann wird das Gemisch aus Transfektions-reagenz und Opti-MEM zu dem DNA-/Opti-MEM-Gemisch hinzugegeben; dieses Gemisch wird wieder kurz gevortext und mit einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Nach 15 bis 30 min Inkubati-onszeit wird das Nanofectin-/DNA-Opti-MEM-Gemisch tröpfchenweise auf die Zellen (normale

46 Transfektion) beziehungsweise direkt in ein Well einer 12-Well-Zellkulturplatte (reverse Trans-fektion) gegeben. Ein Mediumwechsel erfolgt nicht. Nach 24 h Inkubationszeit werden die Zellen entweder für die weitere Analyse lysiert oder infiziert.

Transfektion mit TransIT-LT1:

Für einen einzelnen Transfektionsansatz mit TransIT-LT1 wird 0,5 µg DNA in einem Reaktionsge-fäß mit 100 µl Opti-MEM durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Da das vom Hersteller opti-male DNA-TransIT-LT1-Verhältnis 1:3 ist, werden 1,5 µl TransIT-LT1 zu dem DNA-Opti-MEM-Ge-misch hinzugegeben und wieder durch Auf- und Abpipettieren geDNA-Opti-MEM-Ge-mischt. Nach einer Inkubati-onszeit von 15 bis 30 min wird das Transfektionsgemisch tröpfchenweise auf die Zellen (normale Transfektion) oder direkt in ein Well einer 12-Well-Zellkulturplatte gegeben (reverse Transfek-tion). Auch hier erfolgt kein Mediumwechsel. Nach 24 h Inkubationszeit werden die Zellen ent-weder für die weitere Analyse lysiert oder infiziert.

6.2.3.2 Transfektion von siRNA

Die Transfektion von siRNA erfolgt mit Lipofectamine RNAiMAX von Life Technologies. Sie wird revers ausgeführt, das heißt, dass ein siRNA-Transfektionsgemisch in ein Well einer 12-Well-Zellkulturplatte vorgelegt wird und darauf Zellen in Zellkulturmedium ausgesät werden.

Für den Knockdown von Nedd4 werden HeLa-Zellen (siehe 5.2.1), für den Knockdown der 7SK-RNA werden A549-Zellen (siehe 5.2.1) verwendet. 50 nM si7SK-RNA (finale Konzentration) werden in einem Reaktionsgefäß in 100 µl Opti-MEM aufgenommen und durch Vortexen vermischt; da-nach wird mit einer Tischzentrifuge kurz zentrifugiert. In einem anderen Reaktionsgefäß werden 1,6 µl Lipofectamine RNAiMAX mit 100 µl Opti-MEM vermischt, ebenfalls kurz gevortext und mit einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Dann wird das siRNA-Opti-MEM-Gemisch zu dem Lipofecta-mine RNAiMAX-Opti-MEM-Gemisch gegeben. Dieses Gemisch wird wieder gevortext und mit Hilfe einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Nach 5 min Inkubationszeit wird der Ansatz in ein Well einer 12-Well-Zellkulturplatte vorgelegt, so dass darauf Zellen in der erwünschten Konzentration ausgesät werden können. 4 h nach Transfektion wird mit Hilfe eines Lichtmikroskops kontrol-liert, ob sich alle Zellen auf dem Boden abgesetzt haben; wenn dies der Fall ist, kann ein Medi-umwechsel stattfinden. Insgesamt erfolgt die Inkubation der Zellen mit siRNA für 48 h. Im Falle eines Knockdowns der 7SK-RNA werden die Zellen nach dieser Inkubationszeit infiziert und wei-ter analysiert. Im Falle eines Knockdowns von Nedd4 werden die Zellen ein weiwei-teres Mal mit siRNA transfiziert. Dazu wird der in den Wells der 12-Well-Zellkulturplatte vorhandene

Über-Methoden

47 stand abgesaugt und die Zellen werden einmal mit vorgewärmten PBSdef gewaschen. Dann wer-den sie mit Hilfe von 500 µl 0,05 % Trypsin-EDTA im Inkubator vom Bower-den der Zellkulturplatte abgelöst. Die Reaktion wird mit 1,5 ml vorgewärmtem Zellkulturmedium abgestoppt und alle Zellen, die mit derselben siRNA behandelt worden sind, werden vermischt. Nun wird erneut siRNA wie oben beschrieben zusammenpipettiert und in Wells einer neuen 12-Well-Zellkultur-platte gegeben. Darauf werden die abgelösten, einfach-transfizierten Zellen in der gewünschten Konzentration ausgesät. Nach 4 h erfolgt wieder ein Mediumwechsel. Die gesamte Inkubations-dauer beträgt nach der zweiten Transfektion nur 24 h; danach werden die Zellen infiziert und weiter analysiert.

6.2.4 Mycoplasmentest und -behandlung

Zellen und Virusstocks werden mittels PCR (polymerase chain reaction, siehe 6.4.2) auf Myco-plasmen getestet und im Falle eines positiven Ergebnisses mit Plasmocin von InvivoGen behan-delt.

Für die Mycoplasmen-PCR wird aus dem Zellkulturmedium der zu testenden Zelllinie oder des Virusstocks mit Hilfe des Qiagen Viral RNA Mini Kit DNA isoliert. Dann erfolgt eine PCR mit der JumpStart Taq DNA-Polymerase (siehe 5.7) und den Mycoplasmen-spezifischen Primern # 437 und # 438 (siehe 5.5.1, Reaktionsansatz und PCR-Programm siehe Tabelle 6.1).

Tabelle 6.1: Reaktionsansatz und PCR-Programm für Mycoplasmen-Test

Reaktionsansatz

Komponente Volumen

Primer # 437 (100 µM, finale Konzentration 1 µM) 0,25 µl Primer # 438 (100 µM, finale Konzentration 1 µM) 0,25 µl dNTPs (2 mM, finale Konzentration 0,12 mM) 1,5 µl MgCl2 (50 mM, finale Konzentration 1,66 mM) 0,83 µl

JumpStart Taq DNA-Polymerase 0,5 µl

H2O 20,67 µl

DNA aus DNA-Isolation 1 µl

PCR-Programm

Temperatur Zeit Wiederholung

94 °C 5 min ---

94 °C 30 sec

x 35

55 °C 30 sec

72 °C 30 sec

72 °C 10 min ---

48 Das PCR-Produkt wird dann auf einem 1,5 %-Agarosegel aufgetragen und bei 100 V einer Elek-trophorese für 45 min unterzogen. Danach wird das 1,5 %-Agarosegel für 30 min in Ethidium-bromid inkubiert und mittels UV-Licht (λ = 302 nm) analysiert.

Im Falle eines positiven PCR-Ergebnisses werden die Zellen über mehrere Tage bis Wochen hin-weg mit 25 µg/ml Plasmocin, das dem Zellkulturmedium zugegeben wird, behandelt.