3.2.1 Langzeitlagerung von Säugerzellen
Die Langzeitlagerung von eukaryotischen Zellen ist in flüssigem Stickstoff bei -196°C möglich. Diese Lagerung bewahrt die Zellen vor Kontamination und vor Variabilität durch Subkultivierung. Als Schutzsubstanz dient 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), welches die Kristallbildung innerhalb und außerhalb der Zellen sowie partielle Dehydration des Cytoplasmas verhindert.
Vor dem Einfrieren wurden die Zellen bis zu einer Konfluenz von 80% in 175 cm2 -Zellkulturflaschen kultiviert. Nach zweimaligem Waschen mit auf 37°C vorgewärmtem PBSdef wurden sie durch Zugabe von 2 ml Trypsin-EDTA vom Untergrund abgelöst. Nach der mikroskopischen Kontrolle wurden 3 ml DMEM10%FCS (A.1) zugegeben und die Zellen durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Es folgte eine Zentrifugation der Zellsuspension für 5 Min. bei 4°C und 1 200 rpm (Zentrifuge 5 417R) in Schraubröhrchen. Das Pellet wurde in 900 µl DMEM20%FCS, 10%DMSO
resuspendiert und in ein Kryoröhrchen gegeben, in dem bereits 900 µl DMEM20%FCS, 10%DMSO vorgelegt waren. Die Zellen wurden in einer mit Isopropanol gefüllten Einfrierbox über Nacht bei -80°C gelagert, bevor sie in den Stickstofftank zur Langzeitlagerung überführt wurden. Das Auftauen der Zellen erfolgte bei 37°C im Wasserbad. Die gesamte Zellsuspension wurde in eine 25 cm2-Zellkulturflasche mit 5 ml DMEM10%FCS gegeben und bis zur Konfluenz kultiviert. Für die nächsten vier Zellkulturpassagen (3.2.2) wurden je 400 µl „MycoKill“ (A.1) pro 20 ml DMEM10%FCS zugegeben, um eventuell vorhandene Mykoplasmen zu zerstören. Im Anschluss wurden die Zellen unter Verwendung des „MycoAlert Mycoplasma Detection Assays“
(A.6) auf die Anwesenheit von Mykoplasmen untersucht.
3.2.2 Kultivierung von Säugerzellen
Die Inkubation aller Zelllinien erfolgte in einer feuchten, 5%igen CO2-Atmosphäre bei 37°C im Brutschrank. Zweimal pro Woche wurden die Zellen subkultiviert. Hierzu wurden in einer 75 cm2-Zellkulturflasche konfluent gewachsene Zellen zweimal mit auf 37°C vorgewärmtem PBSdef gewaschen und durch die Zugabe von 2 ml Trypsin-EDTA vom Untergrund abgelöst. Nach der mikroskopischen Kontrolle wurden 8 ml DMEM10%FCS (A.1) zugegeben und die Zellen durch Auf- und Abpipettieren
resuspendiert. Entsprechend der benötigten Dichte wurden die Zellen in 20 ml oder 40 ml DMEM10%FCS (75 bzw. 175 cm2-Flasche) umgesetzt.
Zum Aussäen der Zellen in Zellkulturplatten wurde jeweils die Zellzahl unter Verwendung der Neubauer-Zählkammer bestimmt (siehe folgender Abschnitt).
3.2.3 Zellzahlbestimmung
Die Bildung der sogenannten „Newtonschen Ringe“ zeigte den korrekten Sitz des Deckgläschens auf der Neubauer-Zählkammer an. Somit wurde ein definierter Raum von 0,1 mm3 = 0,1 µl pro Großquadrat geschaffen, in den die Zellsuspension durch Adhäsionskräfte eingebracht wurde. Unter dem Mikroskop wurde die Zellzahl bei 10-facher Vergrößerung bestimmt. Dazu wurden alle vier Großquadrate ausgezählt (1 Großquadrat = 16 Kleinquadrate) und deren Durchschnittswert bestimmt. Diese Zellzahl pro 0,1 µl Volumen wurde auf Zellen pro µl umgerechnet (x 10). Die je Vertiefung einer Zellkulturplatte gewünschte Zellzahl wurde dann durch den erhaltenen Wert geteilt und das Ergebnis entsprach der benötigten Menge der Zellsuspension angegeben in µl.
3.2.4 Transfektion von Säugerzellen mit der Calciumphosphat-Methode
Die Calciumphosphat-Transfektion wurde für die Reporter-Gen-Analysen unter 4.1 verwendet. Durch diese Methode kann eine 100%ige Transfektionsrate erreicht werden, ohne dass die IFN-Antwort in transfizierten Zellen ausgelöst wird. Verwendet wurden im Folgenden die Komponenten des „Calciumphosphate Transfection Kits“
von Invitrogen (A.1). Die Transfektion der 293M-Zellen (1x 106 pro Ansatz, A.9) erfolgte in Suspension mit je 0,3 µg des Firefly-Luziferase-Reporterplasmids pHISG54-Luz und des Renilla-Luziferase-Reporterplasmids pRL-SV40 und 4 µg der zu testenden Expressionsplasmide (Dual-Luziferase-Assay, 3.4.5). Zur besseren Aufnahme der DNA in die Zellen wurden 16 µg Carrier-DNA („Herring Sperm DNA“, Promega) zu jedem Ansatz gegeben. Die DNA wurde in 264 µl ddH2O Endvolumen gemischt bevor 36 µl Calciumchlorid (in zwei Schritten) vorsichtig hinzupipettiert wurden. Das Mischen dieses DNA-Ansatzes mit 300 µl HBS-Puffer erfolgte durch Einträufeln der DNA in den HBS-Puffer, in dem gleichzeitig Luftblasen erzeugt wurden. In der anschließenden Inkubationszeit von 30 Min. wurden 293M-Zellen (75 cm2-Flasche) für die Transfektion abtrypsiniert (3.2.2), ausgezählt (3.2.3) und die
entsprechende Menge pro Ansatz bei 4°C und 200 x g für 5 Min. zentrifugiert. Die Zellen wurden im Transfektionsgemisch resuspendiert. Das Zell-Transfektionsgemisch wurde nach weiteren 15 Min. in eine 10 cm-Schale mit 10 ml DMEM2%FCS (A.1) gegeben. Nach einer 24-stündigen Inkubation im Brutschrank (37°C, 5% CO2) wurde ein Teil der Ansätze mit Sendai-Virus (SeV, 20 hämagglutinierende Einheiten) zur Induktion des Typ-I-IFN-Systems infiziert (3.3.3).
24 h p.i. wurden die Zellen für 15 Min. in 100 µl Passiv-Lysis-Puffer lysiert und nach den Angaben des „Dual-Luciferase Reporter Assay-Kits“ (3.4.5) analysiert. Die erhaltenen Firefly-Luziferase-Werte wurden mit Hilfe der Renilla-Luziferase-Werte als Maß für die Transfektionseffizienz normalisiert.
3.2.5 Transfektion von Säugerzellen mit L2000 oder FuGENE 6
Lipofectamine 2000 (L2000)
Zellen unterschiedlicher Konfluenz (20 - 80%) wurden einmal mit DMEM0%FCS, – P/S
gewaschen, wobei 2 ml DMEM0%FCS, – P/S auf den Zellen verblieben. Die Zellen wurden mit einem Verhältnis von DNA zu L2000 von 1 zu 3 transfiziert. Die DNA und die erforderliche Menge an L2000 wurden getrennt voneinander zu jeweils 150 µl Optimem in Mikro-Schraubröhrchen gegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation des L2000-Ansatzes bei Rt wurde dieser zum DNA-Ansatz gegeben. Es folgte eine Inkubation von 20 Min. bei Rt, bevor der DNA-Liposomen-Komplex vorsichtig auf die Zellen gegeben und für 4 bis 6 Std. bei 37°C inkubiert wurde. Das Medium wurde anschließend durch 2 ml DMEM2%FCS ersetzt und die Inkubation über Nacht oder für 48 Std. fortgesetzt.
FuGENE 6 Transfection Reagent
Zellen unterschiedlicher Konfluenz (20 - 80%) wurden zweimal mit DMEM0%FCS, – P/S
gewaschen, wobei 1 ml DMEM0%FCS, – P/S auf den Zellen verblieben. Die Zellen wurden mit einem Verhältnis von DNA zu FuGENE 6 von 1 zu 3 transfiziert. Die DNA wurde zu 200 µl DMEM0%FCS, – P/S und die erforderliche Menge an FuGENE zu 800 µl DMEM0%FCS, – P/S gegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation des FuGENE-Ansatzes bei Rt wurde dieser zum DNA-Ansatz gegeben. Nach 20 Min. bei Rt wurde der DNA-Liposomen-Komplex auf die Zellen gegeben und für 4 bis 6 Std. bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde anschließend durch 2 ml DMEM2%FCS ersetzt und die Inkubation über Nacht oder für 48 Std. fortgesetzt.
3.2.6 Ernte und Lyse von Säugerzellen
Ernte in Chaps-Puffer
Zellen in denen Caspasen und deren Spaltprodukte nachgewiesen werden sollten, wurden in Chaps-Puffer geerntet. Nach einer Infektion oder Transfektion wurden die Zellen zweimal mit PBSdef gewaschen und im Anschluss in 50 µl Chaps-Puffer (Cell Signaling) durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen lysiert. Dieser Puffer wurde zuvor mit 5 mM DTT und einem Protease Inhibitor Mix (1x Complete Tablette, Roche) versetzt. Es folgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 14 000 rpm (Zentrifuge 5 417R) und 4°C. Der Überstand wurde mit der gleichen Menge 2x SDS-Probenpuffer vermischt und für Western Blot-Analysen (3.4.1 und 3.4.2) verwendet.
Proben aus dem BSL4-Labor wurden nach Zugabe des SDS-Probenpuffers in neue Safe-Lock Reaktionsgefäße (A.4) überführt, 10 Min. im Wasserbad gekocht und durch das Ausschleusbad (5% Microchem) aus dem Sicherheitsbereich gebracht.
Ernte in Zelllysis-Puffer (CLP)
Für alle Western Blot-Analysen mit phosphospezifischen Ak wurden Zellen in CLP geerntet, da dieser Puffer drei Phosphatase-Inhibitoren beinhaltet. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion oder PPMO-Behandlung wurden die Zellen zweimal mit PBSdef gewaschen. Die Lyse erfolgte in 80 µl Cell Extraction Buffer (CLP, Biosource) für 20 Min. auf Eis. Der Puffer wurde zuvor mit 0,1 µM des Serin/Threonin Phosphatase Inhibitors Calyculin A (Cell Signaling) und einem Protease Inhibitor Mix (1x Complete Tablette, Roche) versetzt. Es folgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 14 000 rpm (Zentrifuge 5 417R) und 4°C. Der Überstand wurde im Anschluss mit der gleichen Menge 2x SDS-Probenpuffer vermischt und für Western Blot-Analysen verwendet (3.4.1 und 3.4.2). Proben aus dem BSL4-Labor wurden wie im vorigen Abschnitt beschrieben inaktiviert.
Ernte von Zellen zur Expressionskontrolle
Nach der Transfektion mit L2000 (48 Std., 3.2.5) zur Expression verschiedener Proteine wurden die Zellen zweimal mit PBSdef gewaschen, in 300 µl PBSdef
abgekratzt und mit der gleichen Menge 2x SDS-Probenpuffer zur Lyse vermischt.
Unterschiedliche Mengen dieser Lysate (5 - 30 µl) wurden für Western Blot-Analysen (3.4.1 und 3.4.2) verwendet.