Zellbiologische Methoden

Alle Zellkulturexperimente wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt und die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 in humider Atmosphäre kultiviert.

6.2.2.1 Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark der Maus

Die Gewinnung muriner MZ (engl. bone marrow-derived cultured mast cells, BMcMCs) erfolgte nach dem Protokoll von Mrabet-Dahbi et al.¹⁴⁷. BMcMCs können als MZ-Progenitor-Zellen¹⁴⁸ bezeichnet werden. Sie gehören zu den unreifen MZ¹⁴⁹ und werden den mukosalen MZ zugeordnet¹⁵⁰. BMcMCs wurden aus murinen Knochenmarkszellen in einer 4-6-wöchigen Kultur unter Zusatz von murinem, rekombinanten Interleukin 3 (mrIL-3) generiert, welches die Zellen in ihrem Wachstum und ihrer Differenzierung fördert⁴⁷.

Femora und Tibiae einer Maus wurden sorgfältig von Geweberesten befreit und bis zur weiteren Verwendung in 50 ml Transportmedium aufbewahrt. Alle weiteren Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Kondylen wurden abgeschnitten, das Knochenmark mit einer 25 Gauge Kanüle herausgespült und mit einer 10 ml Pipette durch mehrmaliges Resuspendieren aufgebrochen. Anschließend wurden die Zellen bei 1300 rpm, 4 °C für 10 min zentrifugiert, in 20 ml Kulturmedium aufgenommen und in eine 75 cm² Gewebezellkulturflasche überführt. Um die adhärenten Stromazellen von den suspensiven MZ zu separieren, wurde an Tag 5, 8, 10 und 15 der Kultur ein vollständiger Mediumwechsel durchgeführt. Ab Tag 19

wurde das Medium zweimal wöchentlich gewechselt, wobei einmal ein 50%iger Mediumwechsel und einmal ein vollständiger Mediumwechsel durchgeführt wurde.

Der Wachstumsfaktor mrIL-3, wurde bei jedem Mediumwechsel in einer Endkonzentration von 10 ng/ml frisch hinzugegeben. Die Vitalität der Zellen wurde mittels Trypanblaufärbung mikroskopisch überprüft und zusätzlich über den CASY Cell Counter bestimmt. Um die Reinheit der Zellen zu überprüfen, erfolgte eine Färbung mit Toluidinblau, welches die Granula der MZ metachromatisch anfärbt.

Zusätzlich wurde die Reinheit der Zellen über die Expression von FcεRI und Kit im Durchflusszytometer (siehe 6.2.3.5) bestimmt.

Abbildung 11 Lichtmikroskopische Aufnahme einer murinen Mastzellkultur. Isolierte Knochenmarkszellen (A) 5 Tage nach Kultivierung (B) Mastzellkultur nach 4-wöchiger Kultivierung bei einer 200-fachen Vergrößerung.

6.2.2.2 Isolierung und Kultivierung von Mastzellen aus dem Peritoneum der Maus Die Isolierung von MZ aus dem Peritoneum wurde ebenfalls nach Protokoll von Mrabet-Dahbi et al. durchgeführt¹⁴⁷. Im Gegensatz zu BMcMCs ähneln peritoneale MZ phänotysch den Bindegewebsmastztellen^{147, 150}.

Frisch isolierte Zellen aus der peritonealen Lavage (engl. peritoneal lavage cells, PLC) bestehen zu maximal 5% aus MZ¹⁵⁰. Um eine möglichst reine MZ-Population zu erhalten ist die Kultivierung mit den Zytokinen mrIL-3 und murinem, rekombinantem SCF (mrSCF) erforderlich^{147, 150}. Zu diesem Zweck wurde die Maus zunächst durch zervikale Dislokation euthanasiert, das Peritoneum freigelegt und sofort desinfiziert. Mit einer 26 Gauge Kanüle wurden 5 ml 2 mM EDTA/PBS zusammen mit 5 ml Luft in den Bauchraum der Maus injiziert ohne das Gewebe zu verletzen. Um die peritonealen Zellen zu lösen, wurde die Maus für 3 min hin und her bewegt und die Suspension mit einer 20 Gauge Kanüle aus dem Bauchraum der Maus in ein Falcon überführt, was bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert

wurde. Alle weiteren Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Zellen wurden bei 1300 rpm für 10 min bei 4 °C pelettiert, in 5 ml Kulturmedium aufgenommen und in eine Gewebekulturflasche mit 25 cm² Wachstumsfläche überführt. Um die Ausbeute der MZ zu erhöhen, wurden für die Herstellung einer Kultur 2-3 Mäuse genutzt. Die Zellen wurden frisch mit mrIL-3 (10 ng/ml) und mrSCF (30 ng/ml) versetzt¹⁵⁰. Am 2. Tag wurden die Suspensionszellen abgenommen und die Kultur mit 5 ml frischem Medium und Zytokinen versorgt. Am 5. Tag wurden erneut 5 ml Medium hinzugefügt und die Kultur erneut mit Zytokinen versetzt. Nach 8-9-tägiger Kultivierung konnten die Zellen für Experimente genutzt werden. Unter diesen Kultivierungsbedingungen ist es möglich eine Reinheit der Kultur von 95% zu erreichen¹⁴⁷

6.2.2.3 Vorbehandlung von Mastzellen mit Ramipril/Metoprolol und Analyse der Histaminfreisetzung

Eine häufig angewandte Methode zur Überprüfung einer MZ- Degranulation ist die Quantifizierung des MZ-Mediators Histamin. Dafür wurden pro Reaktionsansatz mindestens 2x10⁵ BMcMCs verwendet. Die Zellen wurden über Nacht mit IgE (1 µg/ml) beladen, am folgenden Tag mit PAG-CM Puffer gewaschen und mit verschiedenen Konzentrationen Ramiprilat (die aktive Form von Ramipril), Metoprolol oder Bradykinin (akkumuliert während der Einnahme von Ramipril im Organismus) allein und in unterschiedlichen Kombinationen für 20 min bei 37° C vorinkubiert. Die verwendeten Konzentrationen der Medikamente basieren auf klinischen Plasmakonzentrationen, welche bei Einnahme der Medikamente während einer Herz-Kreislauf-Therapie entstehen können^151-153. Je 3 unbehandelte Reaktionsansätze dienten als Kontrolle und wurden für die Analyse gemittelt. Die MZ wurden für weitere 25 min bei 37 °C mit 0,4 µg/ml oder 4 µg/ml anti-IgE aktiviert (=

Stimulierte Histaminfreisetzung). Der entsprechende Isotyp wurde mitgeführt und Calcium Ionophor A23187 (2 µM) diente in allen in vitro Experimenten als Positivkontrolle für eine erfolgreiche Degranulation. Um die spontane Histaminfreisetzung zu bestimmen, wurden die Zellen nicht mit anti-IgE stimuliert, sondern für 25 min in PAG-CM belassen. Der Gesamtgehalt von Histamin wurde durch Zelllyse mit 1% Perchlorsäure bestimmt. Alle Reaktionsansätze wurden nach 25-minütiger Inkubation mit kaltem PIPES abgestoppt, bei 1300 rpm, 4 °C für 10 min

zentrifugiert und die Histaminfreisetzung in den Überständen der Zellen im Histamin-Autoanalyzer bestimmt^{154, 155}. Die Net Histaminfreisetzung wurde nach folgender Formel berechnet: Net Histaminfreisetzung (%)= [(Stimulierte Histaminfreisetzung - spontane Histaminfreisetzung /Gesamthistamingehalt]*100.

6.2.2.4 Vorbehandlung von Mastzellen mit Acetylsalicylsäure und Analyse der Histaminfreisetzung in vitro

BMcMCs oder PcMCs wurden über Nacht mit IgE (1 µg/ml) beladen, am folgenden Tag mit PAG-CM gewaschen und für 20 min bei 37 °C mit unterschiedlichen Konzentrationen ASS inkubiert. Je 3 unbehandelte Reaktionsansätze dienten als Kontrolle und wurden für die Analyse gemittelt. Die Stimulation der Zellen erfolgte mit anti-IgE (4 µg/ml) für weitere 25 min bei 37 °C, während die Zellen für die spontane Histaminfreisetzung in PAG-CM belassen wurden. Um den Gesamthistamingehalt zu bestimmen wurden die Zellen mit Triton X-100 aufgeschlossen. Die Überprüfung der Histaminfreisetzung im Histamin-Autoanalyzer und im Histamin-ELISA zeigte, dass die Detektion des Histamins mit beiden Methoden vergleichbare Ergebnisse lieferte.

Da die Ausbeute von PcMCs gering war, musste die Bestimmung des Histamingehalts mit dem sensitiveren Histamin ELISA durchgeführt werden. Die Net-Histaminfreisetzung wurde nach obiger Formel berechnet und auf den unbehandelten Zellansatz normiert.

6.2.2.5 Vorbehandlung der Mäuse mit Acetylsalicylsäure und ex vivo Stimulation der Mastzellen

Bei diesem Experiment wurden nicht die Zellen, sondern die Mäuse direkt mit ASS (50 mg/kg) für 3 Tage behandelt. Am 3. Tag wurden die Zellen des Peritoneums wie in 6.2.2.2 beschrieben isoliert und die Mischzellkultur (MZ, Fibroblasten, Leukozyten, Makrophagen)¹⁵⁶ direkt nach Entnahme unter sterilen Bedingungen mit 10 µg/ml anti-IgE stimuliert, um eine möglichst hohe MZ Degranulation zu erzielen. Die Net Histaminfreisetzung wurde mittels Histamin ELISA nach Herstelleranweisungen bestimmt und auf den unbehandelten Zellansatz normiert.