Zellbiologische Methoden

Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurde mit zwei adhärenten eukaryotischen Zelllinien gearbeitet. Zur Expression der murinen H1-und H3-Rezeptoren unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems wurden Sf9-Zellen verwendet (siehe Schritt 3.2.19). Zur weiteren Expression und Untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften der murinen H1R und H4R wurde die Fibroblaste Zelllinie NIH-3T3 als eukaryotisches Expressionssystem genutzt.

Dazu wurden diese Zellen mit dem Plasmid mH1R oder dem Plasmid mH4R, welche an ein GFP (Green Fluorenscent Protein) fusioniert wurden, mithilfe von Lipofectamin 2000 transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden für weitere pharmakologische Folgeversuche eingesetzt.

3.4.1 Kultivierung von NIH-3T3-Zellen

NIH-3T3-Zellen wurden in einer Dichte von 1-2 x 10⁶ Zellen pro 25 oder 75 cm² Zellkulturflasche bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Das DMEM-Medium der NIH-3T3-Zellen war mit 10 % FKS, 1 % Glutamin und 1 % Pen-Strep angereichert worden. Das Zellenmedium wurde alle 48 h gewechselt. Die Zellen besitzen eine Verdopplungszeit von 24 h, deshalb werden sie alle drei bis vier Tage auf eine neue Zellkulturflasche ausgesät. Hierzu wurden die Zellen zweimal mit warmen PBS gewaschen. Durch Zugabe des Trypsin wurden die Zellen vom Boden der Kulturflasche abgelöst. 3 ml DMEM-Medium wurde zu den Zellen gegeben und diese im Anschluss 8 min bei 1500 rpm abzentrifugiert. Schließlich wurden 5 bis 10 ml DMEM-Medium hinzugegeben und die Zellzahl mithilfe einer Neubauer-Kammer bestimmt. Danach wurden die Zellen erneut ausgesät.

3.4.2 Konservieren von NIH-3T3-Zellen

Zum Konservieren der NIH-3T3-Zellen wurden 80 % konfluente Zellen abgelöst und pelletiert.

Das Pellet wurde in 1 ml kaltem Einfriermedium (70 % DMEM-Medium, 20 % FKS, 10 % DMSO) resuspendiert. Die Kryoröhrchen wurden bei -80 °C oder im Stickstofftank gelagert.

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Zum Auftauen der NIH-3T3-Zellen wurden die Kryoröhrchen im 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut und in 15 ml Röhrchen mit 5 ml DMEM-Medium überführt. Die Zellen wurden 8 min bei 1500 rpm abzentrifugiert. Das Medium wurde verworfen. In 3 ml DMEM-Medium wurden die Zellen resuspendiert, in eine 25 cm² Kulturfasche überführt und bei 37 °C, 5 % CO2

inkubiert.

3.4.3 Transfektion der NIH-3T3-Zellen

Die Transfektion der NIH-3T3-Zellen mit dem Plasmid GFP-mH1R oder dem Plasmid GFP-mH4R wurde mithilfe des Lipofectamins 2000 durchgeführt. Bei diesem Verfahren bildet die Plasmid-DNA mit einer kationischen Lipid-Reagenz einen Komplex. Dabei werden die positiv geladenen Lipide mit der negativ geladenen DNA verbunden. Dieser neu entstandene lipophile und positiv geladene Komplex kann sich nun an die negativ geladene und hydrophobe Zellmembran binden.

Hierzu wurden die Zellen vom Vortag in einer 12-Well Kulturplatte mit einer Zahl von 300.000 Zellen pro Welle ausgesät. Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 wurden diese mit serumfreiem DMEM-Medium gewaschen und anschließend mit 1 ml serumfreiem DMEM-Medium überschichtet.

Zur Transfektion wurden zwei Lösungen hergestellt:

 Lösung A: 2 μg Plasmid GFP-mH1R oder Plasmid GFP-mH4R in 100 μ1 Transfektionsmedium (Opti-MEM Medium oder serumfreies DMEM Medium)

 Lösung B: 4 μ1Lipofectamin 2000 Reagent in 100 μ1 Transfektionsmedium (Opti-MEM Medium oder serumfreies D(Opti-MEM Medium). 5 min in Raumtemperatur inkubiert.

Die DNA und Lipofectamin-Lösungen wurden vorsichtig gemischt und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 300 μ1 Transfektionsmedium wurde das Gemisch langsam und tropfenweise zu den Zellen gegeben. Anschließend wurden die Zellen 3 bis 4 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Danach wurde das Transfektionsgemisch abgenommen. Nach

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Zugabe von 1 ml DMEM-Medium (mit 10 % FKS, 2 Mm Glutamin und 1 % Pen-Strep) wurden die Zellen 48 h kultiviert. Sie können bereits nach 24 h für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet werden.

3.4.4 Proteinanalytik

Zum Proteinnachweis der Plasmide GFP-mH₁R oder GFP-mH₄R in transfizierten NIH-3T3-Zellen wurde die Western-Blot-Methode unter Verwendung von Antikörpern gegen das fluoreszierende Protein GFP durchgeführt. Dazu wurde nach Transfektion der NIH-3T3-Zellen in einer 6-Well Kulturplatte und einer Inkubationszeit von 48 h das Medium abgenommen. Die Zellen wurden zweimal mit warmem PBS gewaschen. Nachfolgend wurde die Kulturplatte auf Eis gestellt und pro Well 200 μl Zell-Lysepuffer zugegeben. Die Platte wurde 5 min auf Eis geschüttelt. Dann konnten die abgelösten Zellen in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und für 5 min in einem Ultraschall-Bad weiter lysiert werden. Durch eine zehn minütige Zentrifugation bei 20.000 g und 4 °C wurden die Zellkerne sedimentiert. Der Überstand mit den gelösten Proteinen wurde in ein neues Reaktiongefäß überführt und bei -80 °C gelagert.

3.4.5 SDS-PAGE und Western-Blot

Nach der Bestimmung der Proteinkonzentrationen (siehe Kapitel 3.3.1) wurden Proteine nach ihrem Molekulargewicht durch das SDS-Gel aufgetrennt. Nachfolgend wurden die aufgetrennten Proteine in einer Transferapparatur auf eine Trägermembran transferiert. Der Proteintransfer erfolgte bei 0,75-1 mA/cm² und dauerte 1-2,5 h. Die Arbeitsschritte wurden bereits in Kapitel 3.3.2 und 3.3.3 beschrieben. Anschließend wurden diese Proteine mithilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen. Dazu wurde die Membran über Nacht auf dem Schüttler mit 5 % Magermilchpulver und im TBST Puffer bei 4 °C blockiert. Am nächsten Tag wurde die Membran mit einem Antikörper gegen GFP (1:1000) in 5 % Milchpulver im TBST Puffer 1 bis 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurde die Membran mit einem sekundären Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die ungebundenen Antikörper wurden durch dreimal Waschen entfernt. Die Membran wurde in eine lichtgeschützte Kassette

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gelegt. Die ECL-Reagenzien wurden im Verhältnis 1:1 gut gemischt und auf die Membran getropft. Dann wurde ein Röntgenfilm nach einer Expositionszeit von 5 sec bis 2 min entwickelt.

Eingesetzte Antikörper

 Erster Antikörper: Anti-GFP Antikörper 1:1000 verdünnt.

 Zweiter Antikörper: Anti-Maus-HRP 1:2000 verdünnt.

3.4.6 RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

Die Rezeptor-spezifische RNA in transfizierten NIH-3T3-Zellen wurde durch RT-PCR nachgewiesen. Für die RT-PCR wurde die Gesamt-RNA in transfizierten NIH-3T3-Zellen mithilfe des RNeasy Mini Kit isoliert. Nach der Transfektion der NIH-3T3-Zellen mit dem Plasmid GFP-mH1R oder dem Plasmid GFP-mH4R (siehe Schritte 3.4.3) wurden die transfizierten Zellen nach einer Inkubationszeit von 48 h bei 37 °C mit 600 μl RLN Puffer lysiert.

Der Zell-Überstand wurde nach 2 min Zentrifugation bei 14000 g abgenommen. Nach Zugabe von 600 μl 70 % Ethanol wurde die Lösung auf RNeasy-Säulen gegeben und bei 8000 g für 15 sek zentrifugiert. Mithilfe des RW1 Puffers und RPE Puffers wurde die Säule mehrmals gewaschen. Danach wurde die Säule durch 2 min Zentrifugation bei 8000 g getrocknet. Nach Zugabe von 30 bis 50 μl RNase-freiem Wasser wurde die Gesamt-RNA durch 1 min Zentrifugation bei 8000 g eluiert. 1 pg-1 μg der Gesamt-RNA-Präparation wurde für die Durchführung der reversen Transkriptionsreaktion eingesetzt. Weitere Schritte wurden nach der Anleitung des SuperScript One-Step RT-PCR Systems mit Platinum Taq durchgeführt. Zur relativen Quantifizierung der mRNA des H4R wurde der Rezeptor mit dem Referenzgen GAPDH verglichen.

50 Die PCR-Programm lautet wie folgt:

50 °C 30 min 95 °C 15 min 94 °C 30 sec

55°C 1 min x 39 Zyklen

68 °C 2 min 72 °C 10 min

Anschließend wurde die Rezeptor-spezifische RNA der Proben durch die Agarose-Gel-Elektrophorese mithilfe einer DNA-Leiter (100 bp DNA Leiter Plus) nachgewiesen.

3.4.7 Migrations-Assay

Nach der Transfektion der NIH-3T3-Zellen mit dem Plasmid GFP-mH1R oder dem Plasmid GFP-mH4R (siehe Schritte 3.4.3) und nach einer Inkubationszeit von 48 h bei 37 °C wurden die transfizierten Zellen für den Assay verwendet. Unter Verwendung des Migrations-Assay wurde die Migration der transfizierten NIH-3T3-Zellen und der Einfluss von Histamin via H1R und H4R gemessen.

Der Migrations-Assay wurde unter Verwendung des Transwell-Systems durchgeführt. Das Transwell-System besteht aus einer Polystyrol-Platte mit 12 Wells, in welche Inserts mit einer Kapillarporenmembran (8 μm Porengröße) eingeführt wurden. Die Wells wurden mit 1 ml DMEM-Medium befüllt. H₁R- oder H₄R- Liganden wurden in verschiedenen Konzentrationen (sieh Tab.4) hinzugegeben. Die transfizierten NIH-3T3-Zellen wurden in einer Dichte von 300.000 Zellen in 300 μl DMEM-Medium auf die Kapillarporenmembran pipettiert. Die Platte wurde 2 h bei 37 °C inkubiert. Danach wurde das Medium von dem Wells abgenommen und in Eppendorfgefäße überführt. Nach einer Zentrifugation von 10 min bei 1000 g wurde der Überstand abpipettiert. Die Zellpellets wurden in dem verbleibenden Restvolumen resuspendiert.

Die Anzahl der migrierten transfizierten NIH-3T3-Zellen wurde mithilfe der

Neubauer-51

Zählkammer unter dem Mikroskop bestimmt. Daraus ergab sich die Anzahl der ausgewanderten transfizierten NIH-3T3-Zellen.

Gezählte Zellzahl x 3 x 10000 x Restvolumen [ml] = ausgewanderte transfizierten NIH - 3T3-Zellen/ml 4

Der Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf die chemotaktische Aktivität der transfizierten NIH-3T3-Zellen wurde durch 30 min Präinkubation einiger Ansätze mit JNJ7777120, bevor sie mit H4R-Agonisten Histamin oder 4-Methylhistamin stimuliert wurden, untersucht.

Tabelle 4: Konzentrationen der für die Versuche verwendeten Substanzen:

Histamin 1 mmol/l

4-Methylhistamin 10 μmol/l

Pyridylethylamin 10 μmol/l

ST1006 1 μmol/l, 10 μmol/l

JNJ7777120 10 μmol/l