T-Zell-Diagnostik

Die Bestimmung der Anzahl und Aktivität verschiedener Populationen erregerspezifischer T-Zellen stellt bei vielen Patienten mit mikrobiellen Infekten eine sehr effiziente Methode dar, um Aufschlüsse über den aktuellen Krankheitsverlauf oder eine bereits überwundene Erkrankung zu erlangen. Des Weiteren sind solche Verfahren beispielsweise zum Überwachen der Effizienz therapeutischer und prophylaktischer Impfungen zur Stimulation einer T-Zellantwort, sowie zum diagnostischen Nachweis von Immunzellaktivitäten bei chronischen Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und bei der Transplantatabstoßung von großer Bedeutung.

Derzeit sind verschiedene Verfahren zur Stimulation unterschiedlicher Populationen von Immunzellen verfügbar, welche in unterschiedlichem Ausmaß für den Nachweis spezifischer Populationen antigenspezifischer Immunzellen geeignet sind.

Der diagnostische Nachweis der Spezifität oder Frequenz von T-Zellen aus einem Patienten erfordert einerseits Verfahren zur Gewinnung der entsprechenden

Immunzellen und zum anderen die Verfügbarkeit geeigneter Reagenzien, um diese spezifisch zu stimulieren. Darüber hinaus bedarf es eines Ausleseverfahrens zum Nachweis reaktiver T-Zellen. Ein routinemäßig verwendetes Verfahren zur Stimulation von T-Zellen beruht auf der Kokultivierung mit autologen, Peptid-präsentierenden APC. Der Nachweis der infolge einer Stimulation aktivierten T-Zellen erfolgt bei CD4⁺ Zellen beispielsweise über die Bestimmung der Zellproliferation oder Zytokinproduktion und bei CD8⁺ CTL über die Messung der Zytokinproduktion bzw.

der Zytotoxizität. Die Proliferation von T-Helferzellen kann anhand des Einbaus des radioaktiven Wasserstoffisotops Tritium in die DNS replizierender Zellen bestimmt werden. Die Fähigkeit von CTL, ihre Zielzellen spezifisch zu lysieren wird in ⁵¹ Chrom-Freisetzungstests ausgenutzt. Dabei werden autologe epitoppräsentierende Zielzellen mit ⁵¹Chrom beladen und dann mit den zu untersuchenden T-Zellen kokultiviert. Bei einer epitopspezifischen Erkennung der ⁵¹Chrom markierten Zielzellen durch eine spezifische CTL wird das radioaktive Isotop infolge der Lyse der Zielzelle in den Überstand freigesetzt und dient als Maß für die spezifische CTL Aktivität. Dieser Versuchsaufbau ist der einzige, der direkt die Funktionalität der CTL beweist. Für diese Methode ist jedoch zur Steigerung der Sensitivität eine Vorstimulation der Zellen erforderlich. Deshalb ist dieses Verfahren zur Bestimmung von CTL Vorläuferfrequenzen nicht geeignet. Des Weiteren besteht die Möglichkeit die spezifische Aktivierung von T-Zellen anhand der damit einhergehenden Zytokinproduktion zu analysieren. Zur Bestimmung der Zytokinproduktion auf Einzelzellebene eignet sich der Elispot-assay oder die intrazelluläre Zytokinfärbung mit anschließender durchflußzytometrischer Analyse. Die letztere Methode bietet hierbei einige Vorteile, da sie die gleichzeitige Bestimmung der Zytokinproduktion aus verschiedenen Zellpopulationen direkt aus dem Vollblut erlaubt. Eine Möglichkeit der Stimulation von T-Zellen beruht auf der direkten Beladung von auf der Oberfläche von APC befindlichen HLA Molekülen mit exogenen Peptiden. So können sowohl CD4⁺ als auch CD8⁺ T-Zellen spezifisch mit Peptiden geeigneter Größe stimuliert werden. Voraussetzung ist allerdings die Kenntnis des jeweiligen Zielepitopes der zu bestimmenden T-Zellpopulation, sowie die Verfügbarkeit des entsprechenden Peptids. Einschränkend wirkt auch, dass in der Regel ein bestimmtes Peptid jeweils nur von einem einzigen HLA Typ präsentiert wird, wodurch das jeweilige Verfahren Probanden angewendet werden kann, die dieses HLA Allel besitzen. Dafür bietet dieses Verfahren ein sehr hohes Maß an Spezifität. Die Beschränkung auf ein T-Zellepitop und die damit verbundene strikte HLA-Restriktion kann durch den Einsatz vollständiger Polypeptide zur Stimulation umgangen werden.

Jedoch werden lösliche Proteine fast ausschließlich über den HLA-Klasse-II Prozessierungs- und Präsentationsweg aufgenommen und sind somit nur zum Nachweis von CD4⁺ T-Helferzellen geeignet.

Eine Möglichkeit vollständige Proteine sowohl dem Klasse-I als auch dem Klasse-II Prozessierungs und Präsentationsweg zuzuführen, beruht auf der Denaturierung dieser mittels Hitze oder Natriumdodecylsulfat (SDS). Im Mausmodell konnte mit diesen Antigenen eine Epitoppräsentation auf HLA-I und HLA-II Molekülen erzielt werden. Beide Verfahren waren jedoch aufgrund ihrer geringen Effizienz zur Stimulation von CD8⁺ T-Zellen (Hitze-denaturiertes Protein) bzw. hohen zytotoxischen Aktivität (SDS-denaturiertes Protein) nur bedingt zur Bestimmung von T-Zellaktivitäten aus humanem Zellgemischen geeignet (Schirmbeck, Deml et al., 1995).

Auch Peptide aus Lysaten virusinfizierter oder entarteter Zellen werden sowohl auf HLA-I und HLA-II Molekülen präsentiert. Da sie aber auch immunologische Danger-Signale beinhalten sind sie per se immunmodulatorisch. Darüber hinaus wurde im Mausmodell gezeigt, dass ihre Effizienz zur Stimulation von T-Zellantworten vergleichbar gering ist (Galea-Lauri, Wells et al., 2004).

Ein anderer Ansatz für die Transfektion von Zellen mit Proteinen beruht auf der Verwendung der bereits erwähnten Proteintransduktionsdomänen (PTD). Hierbei handelt es sich um ein sehr effizientes Verfahren zur Bestimmung von CD4- und CD8-Zellen, da mit PTDs fusionierte Proteine über den HLA Klasse I und II Prozessierungs- und Präsentationsweg gelangen (Mitsui, Inozume et al., 2006). Ein gravierender Nachteil dieser Methode ergibt sich aus der Notwendigkeit, die entsprechenden Fusionsproteine im Vorfeld rekombinant herzustellen. Eine gleichzeitige Epitoppräsentation auf HLA-I und –II Proteinen ist auch durch den Einsatz partikulärer Strukturen zu erreichen. Bei diesem Verfahren werden die Proteine von Interesse in partikuläre Strukturen wie Liposomen, virusähnliche Partikel oder Lipoproteinpartikel integriert (Deml, Speth et al., 2005). Nachteile dieser Methode sind einerseits der hohe Arbeits- und Kostenaufwand zur Herstellung dieser Immunogene und andererseits die Tatsache, dass solche Partikel per se immunmodulatorische Eigenschaften besitzen, welche das erzielte Ergebnis verfälschen können.

Des Weiteren kann eine gleichzeitige Epitopbeladung von HLA-I und II Proteinen durch den Einsatz geeigneter Vektoren, wie Plasmiden, RNS Molekülen oder viralen Vektoren erzielt werden, welche eine endogene Synthese des jeweiligen Proteins bewirken. Beim Einsatz von Plasmiden wirkt sich die geringe Transfizierbarkeit von APC negativ auf ihre Anwendbarkeit aus. Da man einzelne Zellpopulationen in einem Zellgemisch nicht selektiv transfizieren kann, ist es zudem erforderlich die APC zur Transfektion von den zu diagnostizierenden T-Zellen zu trennen um eine Beeinträchtigung deren Funktion zu verhindern. Dadurch wird der Arbeitsaufwand sehr hoch. Dagegen zeigen virale Vektoren oftmals immunmodulatorische Eigenschaften, indem sie entweder die zellulären Mechanismen der

Epitopprozessierung und Präsentation beeinflussen oder per se immunaktivierende Eigenschaften besitzen (Jenne, Schuler et al., 2001;Ribas, 2005).

Kürzlich wurden mit der Tetra- und Pentamertechnologie weitere interessante Verfahren zum Nachweis epitopspezifischer CD8+ CTL und CD4+ T-Helferzellen vorgestellt. Beschränkungen dieser Verfahren für einen breiten Einsatz in der T-Zelldiagnostik sind jedoch in den sehr hohen Kosten für die Herstellung der Di- und Tetramere begründet. Zudem ist die Tetra- und Pentamertechnologie bislang nur für eine begrenztes Repertoire von HLA Typen, insbesondere für häufige HLA Klasse I Proteine, beispielsweise HLA A2 verfügbar. Zudem erlaubt diese Technik nur den Nachweis definierter Epitop-spezifischer Zellen. Die Austestung von T-Zellreaktivitäten gegen multiple Epitope ist mit diesem Verfahren jedoch nur mit einem großen Zeit- und Kostenaufwand durchführbar.

Ein weiteres sehr aktuelles Verfahren zur Messung Antigen-spezifischer T-Zellen beruht auf dem Einsatz peptidbeladener HLA-Moleküle, die mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) gekoppelt sind. Die epitopspezifische Erkennung und Bindung dieser Komplexe durch den TZR führt zu einer Internalisierung der GFP-markierten Peptide, wodurch die entsprechende CTL sichtbar wird (Tomaru, Yamano et al., 2003).

Für diagnostische Zwecke benötigt man, anders als bei Entwicklung neuer Impfstoffe oder Immuntherapieverfahren ein Stimulatorantigen ohne immunmodulatorische Eigenschaften, da keine neuen T-Zellantworten generiert sondern lediglich bereits bestehende reaktiviert werden sollen. Des Weiteren sollte ein Stimulatorantigen für die T-Zelldiagnostik nach Möglichkeit mehrere HLA Klasse I und II restringierte Epitope enthalten, um ein möglichst breites Spektrum an T-Zellsubpopulationen in Individuen unabhängig deren HLA Ausstattung detektieren zu können. Zusätzlich muss ein Verfahren für diagnostische Zwecke möglichst einfach durchzuführen sein, wenn es in der Routinediagnostik Einzug halten soll. Aus diesen Gründen werden Stimulatorantigene benötigt, die sich bestenfalls direkt auf PBMC oder gar in Vollblut einsetzten lässt.