Wirkung des JNK-Inhibitors SP600125 auf die TNF-induzierte Steigerung der

Nihalani et al. zeigten, dass JNK durch Phosphorylierung von JIP an Thr-103 zu einer verminderten Affinität dieses Gerüstproteins für die DLK führt (Nihalani et al. 2003). Eine Dissoziation der DLK vom JIP-1-Komplex resultiert in einer DLK-Dimerisierung, die mit einer Autophosphorylierung und Aktivierung der Proteinkinase verbunden ist.

Um einen Zusammenhang zwischen der enzymatischen Aktivität der DLK und dem JNK-Signalweg zu evaluieren, wurden in-vitro-Kinase-Assay nach Behandlung mit TNF unter Hemmung der JNK mit dem Inhibitor SP600125 durchgeführt.

3.1.3.1 Effizienz der Immunpräzipitation mit dem m5F4-DLK-Antikörper

Um die Effizienz der Immunpräzipitation mit dem m5F4-DLK-Antikörper (Hirai et al. 2006) zu überprüfen, wurden 50% der immunpräzipitierten DLK jeweils nach Zugabe von SDS-Laemmli-Stopppuffer durch Erhitzen von den Protein-A-Agarose-Beads gelöst und 50% des Überstandes, sowie jeweils 200µg des nicht immunpräzipitierten Lysats in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden auf Nitrocellulose-Membranen transferiert und die Proteine im immunologischen Nachweis mit einem Antikörper gegen den C-Terminus der DLK (Holzman et al. 1994) dargestellt.

Abb. 3.5 zeigt, dass die DLK aus dem Lysat mit dem m5F4-DLK-Antikörper immunpräzipitiert werden konnte. Der Immunoblot stellt die DLK-Anteile dar, die nach der Immunpräzipitation vorhanden waren. Pfeil A repräsentiert eine Bande, die dem publizierten Molekulargewicht von 130kDa der DLK entspricht.

Abb. 3.5: Zelluläre DLK kann mit dem DLK-Antikörper von Hirai et al. (2006) aus dem Betazell-Lysat immunpräzipitiert werden. Nach Lyse und Herstellung von Zellextrakten für die Proteincharakterisierung erfolgte die Immunpräzipitation der zellulären DLK mit dem m5F4-DLK-Antkörper (Hirai et al. 2006). Hier dargestellt ist ein Western Blot eines Lysats nach Immunpräzipitation. Der immunologische Nachweis wurde mit einem Antikörper gegen den C-Terminus der DLK (Holzman et al. 1994) durchgeführt. Pfeil A repräsentiert eine Bande, die dem publizierten Molekulargewicht der DLK von 130kDa entspricht.

3.1.3.2 Kinase-Assay mit immunpräzipitierter DLK

Um die Wirkung von TNF auf die enzymatische Aktivität der DLK unter JNK-Inhibition zu untersuchen, wurden Kinase-Assays mit immunpräzipitierter zellulärer DLK durchgeführt.

Die JNK-Inhibition mit 25µM SP600125 erfolgte 60 Minuten vor Behandlung mit TNF. Die entsprechenden Zellen wurden 60 Minuten vor Ernte mit 30ng/ml TNF behandelt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen, des weiteren 10 Minuten vor Ernte mit 5µM Ciclosporin A behandelte Zellen. Analog zu den Kinase-Assays in 3.1.1.2 fand die Immunpräzipitation der zellulären DLK aus dem Zelllysat zur Aufreinigung statt. Dafür wurden 2000µg des Zelllysates mit dem m5F4-DLK-Antikörper (Hirai et al. 2006) eingesetzt, durch den die DLK an Protein-A-Agarose-Beads gekoppelt wurde. 30-50% der immunpräzipitierten Beads wurden im Kinase-Assay mit [³²P]-ATP verwandt, um eine messbare Phosphorylierung des ebenfalls zugefügten universellen Substrates -Casein zu gewährleisten. Nach Ablauf der Reaktion wurden 50% des Überstandes dieser Proben denaturiert und mit einem Molekulargewichtsmarker auf einem 10%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde der Einbau des radioaktiv markierten Phosphats in das Casein anhand der -Strahlung durch einen Phospho-Imager detektiert.

Die Abb. 3.6 A zeigt das Lysat vor Immunpräzipitation und dient als Kontrolle für das gleichmäßige Beladen des Polyacrylamidgels und das gleichmäßige Einsetzen der Proteine in der Immunpräzipitation und damit in den in-vitro-Kinase-Assay. Der immunologische Nachweis wurde mit einem DLK-Antikörper (Holzman et al. 1994) durchgeführt. Die durch Pfeil A markierte Bande bei 130kDa entspricht der publizierten Größe der DLK. Es erfolgte ebenfalls ein Abgleich der Proteinmenge durch einen GAPDH-Antikörper wie in Abb. 3.6 B mit dem Pfeil B dargestellt. Die Abb. 3.6 C zeigt eine Autoradiographie nach Durchführung eines in-vitro-Kinase-Assays mit dem immunpräzipitierten Protein. Die Intensität der Banden korreliert mit dem Einbau von radioaktiv markiertem Phosphat in das entsprechende Protein.

Der Pfeil A markiert eine der Autophosphorylierung der DLK entsprechende Bande bei 130kDa. Auf Höhe des Pfeils C ist die Phosphorylierung des eingesetzten Substrates Casein bei 30kDa zu erkennen. In Abb. 3.6 D ist die quantitative Auswertung der die Casein-Phosphorylierung repräsentierenden Bande dargestellt. Den Ausgangswert bilden die unbehandelten Zellen mit 100 ± 6%, auf den sich die folgenden Werte beziehen. Die Behandlung mit TNFresultierte nach 60 Minuten Inkubationszeit in einer signifikanten Aktivitätssteigerung auf 130 ± 9%. Unter Einwirkung des JNK-Inhibitors SP600125 blieb die TNF-induzierte Zunahme der Aktivität der DLK aus. In dieser Gruppe lag die Aktivität bei 99 ± 9%. Unter alleiniger Einwirkung des JNK-Inhibitors kam es mit 110 ± 10% zu keiner signifikanten Veränderung der enzymatischen Aktivität.

Abb. 3.6 Unter Einwirkung des JNK-Inhibitors SP600125 bleibt die TNF-induzierte Zunahme der Aktivität der DLK aus. Die JNK-Inhibition mit 25µM SP600125 erfolgte 60min vor Behandlung der Zellen mit TNF. Die entsprechenden Zellen wurden 60min vor Ernte mit 30ng/ml TNF behandelt. Die enzymatische Aktivität der immunpräzipitierten DLK wurde in einem in-vitro-Kinase-Assay bestimmt.

Dargestellt sind in 3.6 A und B Western Blots, die zum Nachweis eines gleichmäßigen Einsetzens der Proteinmenge für die Immunpräzipitation mit einem DLK-Antikörper (Holzman et al. 1994) und GAPDH durchgeführt wurden. Pfeil A repräsentiert eine Bande, die dem publizierten Molekulargewicht der DLK von 130kDa entspricht. Die bei 36kDa migrierende GAPDH ist mit dem Pfeil B markiert. Die Abb. 3.6 C zeigt eine typische Autoradiographie nach Durchführung eines in-vitro-Kinase-Assays mit dem immunpräzipitierten Protein. Die Intensität der Banden korreliert mit dem Einbau von radioaktiv markiertem Phosphat in das entsprechende Protein. Der Pfeil A markiert eine der Autophosphorylierung der DLK entsprechende Bande bei 130kDa. Auf Höhe des Pfeils C ist die Phosphorylierung des eingesetzten Substrates Casein bei 30kDa zu erkennen. In Abb 3.6 D ist die quantitative Auswertung von vier unabhängigen Versuchen, die alle in Doppelbestimmung durchgeführt wurden, dargestellt. Mit * gekennzeichnete Daten entsprechen einer signifikanten Änderung. (p≤0,05)