3. Ergebnisse
3.10 Whole-Genome-DNA-Oligonukleotid-Microarray
Um der Haupt-Fragestellung der Arbeit nachzugehen, ob die beiden pDC-Populationen bestimmte Gene aufweisen, die hinsichtlich der Zytokinproduktion auf Subpopulationen innerhalb der pDCs hindeuten lassen und welche immunologische Rolle ihnen damit zuzuschreiben sein kann, wurde ein DNA-Oligonukleotid-Microarray mit Sonden gegen alle ca. 21000 bekannten Gene gespottet, durchgeführt. Mit diesen wurden die Tran-skriptionsprofile der Subpopulationen gemessen.
Es wurden die Profile von acht biologischen Proben in vier Zweifarb-Hybridisierungen, also auf vier Arrays gemessen. Die M-Werte sollten bei allen vier Arrays korrellieren, da sie alle das Differentialprofil von IFN-α-positiven und IFN-α-negativen Zellen dar-stellen. Tatsächlich zeigten aber nur die M-Werte der Arrays I und II eine starke Korre-lation, während die Arrays III und IV untereinander nur schwach korrelierten und zu den Arrays I und II praktisch nicht korrelierten bzw. deutliche systematische Unter-schiede zeigten (Abb 30).
Abbildung 30: Korrellationen der M-Werte der vier Arrays.
Die Zahlen in den Diagrammen zeigen, welche beiden der vier Arrays jeweils miteinander verglichen wurden. Bei idealer Korrelation sollten die M-Werte entlang der grauen Linie liegen.
Es lagen keine Informationen vor, die einen Hinweis darauf hätten geben können, dass die Proben der Arrays III und IV problematisch waren oder die Messung (Amplifikati-on, Markierung, Hybridisierung, Waschen, Scan und Bildauswertung) bei diesen Arrays nicht funktioniert hat. Daher wurde versucht, die Gesamtinformation zu nutzen, gleich-zeitig aber zu berücksichtigen, dass die Ergebnisse bei Verwendung einer Untergruppe der vier Arrays für einzelne Gene deutlich anders aussehen konnten. Schließlich wurden drei verschiedene Analysen durchgeführt, um differentiell exprimierte Gene zu identifi-zieren:
A = Analyse der Arrays I und II B = Analyse der Arrays III und IV
C = Analyse aller vier Arrays gemeinsam
Die Ergebnisse der drei Analysen sind in Abb. 31 zusammenfefasst.
log2-Signalverhältnisse Cy5/Cy3 log2-Signalverhältnisse Cy5/Cy3
Abbildung 31: Ergebnisse der Analysen A, B und C der Microarraydaten (von links nach rechts).
Obere Reihe: MA-Diagramme. Mittlere differentielle Expressionen (M) in Abhängigkeit der mittleren Expression (A). Beide Achsen sind logarithmisch zur Basis 2. Jeder Punkt repräsentiert eine Sonde.
Positive bzw. negative Werte von M zeigen eine stärkere Expression in positiven bzw. IFN-α-negativen Zellen. Je weiter rechts ein Punkt liegt (größere A-Werte), desto größer ist die Spotintensität, gemittelt über IFN-α-positive und IFN-α-negative Zellen, die so als ein ungefähres Maß für die mittlere Transkriptabundanz dient.
Untere Reihe: Vulkan-Diagramme. Empirische Signifikanz der differentiellen Expression in Abhän-gigkeit vom Mittelwert. Beide Achsen sind logarithmisch. Jeder Punkt repräsentiert das Ergebnis für eine Sonde. Je höher ein Punkt liegt, desto kleiner ist der p-Wert des moderierten t-Tests ("empirische Signifi-kanz"). Auf der horizontalen Achse ist der Logarithmus der mittleren differentiellen Expression aufgetra-gen: positive bzw. negative Werte zeigen eine stärkere mittlere Expression in α-positiven bzw. IFN-α-negativen Zellen.
Die Diagramme in der mittleren Spalte von Abb. 31 weisen auf Probleme mit den Ar-rays III und IV hin.
In Abb. 32 erkennt man, dass die Berücksichtigung der möglicherweise problemati-schen Arrays III und IV in der gemeinsamen Analyse (C) die Ergebnisse nicht wesent-lich beeinflussten. Die differentiellen Expressionswerte (LFC: log2 fold-changes, IFN-α-positiv bzw. IFN-α-negativ) korellierten stark, auch die Signifikanzen (–log10(p))
Werte der Arrays III und IV im Vergleich zu den Werten der Arrays I und II deutlich kleiner.
Abbildung 32: Korrelation der Ergebnisse der Analysen A und C der Microarray-daten.
Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert für eine Sonde. Bei idealer Korrelation sollten die Punkte in der Nähe der grauen Linie liegen. Links: Korrelation der LFC-Werte. LFC = log2 differentielle Expression von INF--positiven zu INF--negitiven Zellen. Rechts: Korrelation der Signifikanzen. Gezeigt sind die negativen dekadischen Logarithmen der p-Werte. Größere Werte zeigen eine größere empirische Signifi-kanz der differentiellen Expression.
Eine Auswahl von Kandidatengenen anhand der p-Werte, z.B. unter Kontrolle der Falsch-Positiven-Rate (FDR, false discovery rate) hätte bei Analyse A zu einer un-brauchbar großen Liste geführt. Bei Analyse C wären keine Kandidaten übriggeblieben.
Daher wurde beschlossen, zunächst solche Gene weiter zu betrachten, die in beiden Analysen (A und C) eine mindestens zweifache differentielle Expression zeigten (|LFC|>1), ohne dabei die p-Werte zu berücksichtigen (siehe Anhang, Tab. 12 und 13).
Unter diesen Kandidaten wurde weiteres Augenmerk auf diejenigen Gene gelegt, deren Produkte im Zusammenhang mit Immunzellantworten stehen (Tab. 6 und 7).
Tabelle 6: Interessierende Kandidaten mit differentieller Expression in der IFN-α-positiven Subpopulation
Angegeben sind der Name des Gens, das offizielle Gensymbol sowie zugehörige statistische Werte.
Auswahl basierend auf den Schnittmengen der Ergebnisse der Gruppen A, B und C. Listen dieser Gene mit ausführlicher Annotation befinden sich im Anhang.
IFN-α-positive Subpopulation
Name Gene LFC ± KI Adj. p-value
Pattern Recognition
C-Type Lectin Domain Family 2, Member B CLEC2B 1,71 ± 0,23 < 0,001 C-Type Lectin Domain Family 2, Member D CLEC2D 1,69 ± 0,27 < 0,001
IFN-α-positive Subpopulation
Name Gene LFC ± KI Adj. p-value
Inflammatory Cytokines & Receptors
Interferon-α IFNA2
IFNA4 IFNA5 IFNA6 IFNA8 IFNA10 IFNA14 IFNA21
2,49 ± 0,22 1,16 ± 0,22 1,58 ± 0,22 2,33 ± 0,25 0,99 ± 0,22 2,11 ± 0,22 2,27 ± 0,22 1,26 ± 0,22
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
< 0,001
BMP4 BMP4 1,94 ± 0,24 < 0,001
Interleukin 6 IL6 2,19 ± 0,23 < 0,001
Interleukin 8 IL8 1,88 ± 0,23 < 0,001
Interleukin 10 Receptor-alpha IL10RA 0,94 ± 0,22 < 0,001 Interleukin 12A, p35 IL12A 2,20 ± 0,22 < 0,001 Interleukin 18 Rezeptor assoziiertes Protein IL18RAP 1,49 ± 0,26 < 0,001
Interleukin 28A IL28A 1,20 ± 0,22 < 0,001
Prostaglandin E Receptor PTGER4 1,22 ± 0,23 < 0,001 Synthase und
Prostaglandin-Cyclooxygenase
PTGS2 2,56 ±0,22 < 0,001 T-cell & B-cell Antigen Activation
CD48 CD48 1,77 ± 0,23 < 0,001
Chemokine Ligand 2 CXCL2 0,84 ± 0,23 < 0,001 Chemokine Ligand 3 CCL3 1,01 ± 0,23 < 0,001 Chemokine Ligand 3-like 3 CCL3L3 1,46 ± 0,22 < 0,001 Chemokine Ligand 11 CXCL11 1,56 ± 0,27 < 0,001
Integrin-beta 5 ITGB5 1,48 ± 0,22 < 0,001
Other Genes Related to Immune Cell Response
Indoleamine-2,3-dioxygenase INDO 1,52 ± 0,28 < 0,001 Tissue Factor Pathway Inhibitor 2 TFPI2 1,72 ± 0,26 < 0,001
Adapters, Effectors & Signal Transducers
Adenosin A2b-Receptor ADORA2B 1,93 ± 0,22 < 0,001
Aquaporin 9 AQP9 1,41 ± 0,22 < 0,001
Nexilin NEXN 1,98 ± 0,27 < 0,001
Tabelle 7: Interessierende Kandidaten mit differentieller Expression in der IFN-α-negativen Subpopulation
Angegeben sind der Name des Gens, das offizielle Gensymbol sowie zugehörige statistische Werte.
Auswahl basierend auf den Schnittmengen der Ergebnisse der Gruppen A, B und C. Listen dieser Gene mit ausführlicher Annotation befinden sich im Anhang.
IFN-α-negative Subpopulation
Name Gene LFC ± KI Adj. p-value
Pattern Recognition
C-Type Lectin Domain Family 4, Member A CLEC4A -2,31 ± 0,23 < 0,001
TLR7 TLR7 -0,81 ± 0,22 < 0,001
Inflammatory Cytokines & Receptors Prostacyclin-Receptor/ Prostaglandin I2
-Receptor PTGIR -1,17 ± 0,22 < 0,001
T-cell & B-cell Antigen Activation
CD2 CD2 -1,61 ± 0,22 < 0,001
CD97 CD97 -2,79 ± 0,22 < 0,001
Colony Stimulating Factor 1 Receptor/
CD115 CSF1R -2,52 ± 0,26 < 0,001
Inhibin-beta A INHBA -0,79 ± 0,24 < 0,001
TGF-beta-induced TGFBI -1,53 ± 0,22 < 0,001 TGF-beta Receptor 2 TGFBR2 -2,71 ± 0,22 < 0,001
Other Genes Related to Immune Cell Response
CXXC finger 5 CXXC5 -2,16 ± 0,26 < 0,001
Purinergic Receptor P 2Y, 14 P2RY14 -1,94 ± 0,23 < 0,001 Retinoic Acid Receptor-alpha RARA -2,38 ± 0,24 < 0,001
Secernin 1 SCRN1 -2,04 ± 0,23 < 0,001
Sodium-dependent Phosphate Transporter SLC20A1 -0,39 ± 0,25 < 0,01 Adapters, Effectors & Signal Transducers
Thrombomodelin THBD -2,97 ± 0,23 < 0,001
Die Ergebnisse des DNA-Oligonukleotid-Microarray-Experiments spiegeln einige der Ergebnisse der RT-PCR zu humanen Zytokinen wider. Diese Resultate konnten damit validiert und erweitert werden.
Abb. 30 zeigt die Stärken der differentiellen Expression der interssanten Kandidaten.
Abbildung 33: Differentiell exprimierte Gene zwischen der IFN-α-positiven und der IFN-α-negativen Subpopulation
Die Grafik zeigt die differentielle Expression als mittleren binären Logarithmus des Signalverhältnisses von IFN-α-positiven zu IFN-α-negativen Zellen (LFC). Die Fehlerbalken zeigen die 95%-Konfidenz-intervalle. Die Grafik bildet zum einen die hochregulierten Gene der IFN-α-positiven Subpopulation im Vergleich zu der IFN-α-negativen Subpopulation im DNA-Oligonukleotid-Microarray-Experiment basierend auf den Schnittmengen der Ergebnisse der Gruppen A, B und C ab.