Western Blot Analysen

Für die semiquantitative Bestimmung der Proteinexpression wurde eine definierte Menge des Proteingemisches auf ein Gel aufgetragen und die Proteine elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt. Die entstandenen Proteinbanden werden in einem anschließenden Blot elektrophoretisch aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mittels spezifischer Antikörper und Chemiluminineszenz unter Zuhilfenahme eines Gel Imagers (ChemiDoc^TM BioRad) detektiert.

3.4.4.1 Sodium Dodecyl Sulfat (SDS)-Page

Die Auftrennung der Proteingemische in verschiedenen Mengen, je nach Fragestellung (siehe Tabelle 8 und 9) erfolgte mittels diskontinuierlichen SDS-Page nach LAEMMLI (1970). Vor dem Auftragen auf das Gel wurden die Proteinproben mit einem Denaturierungspuffer behandelt, um eine Linearisierung der Proteine zu erzielen, damit diese unabhängig von ihrer Sekundär- und Tertiärstruktur aufgetrennt werden konnten. Anschließend wurden die Proteingemische auf ein SDS-Sammelgel mit 4,75% Acrylamid und einem darauffolgenden Trenngel mit 8,5% Acrylamid aufgetragen. Dabei wurde zusätzlich ein Größenmarker (Thermo Scientific PageRuler^TM Prestained Protein Ladder) pro Gel hinzugegeben, um bei der Auswertung die Größe der Proteine bestimmen zu können. Die Auftrennung des Proteingemisches erfolgte durch Elektrophorese in einem abgeschlossenen System unter Verwendung von Elektrophoresepufferlösungen (siehe Anhang), wobei zuerst für 30 min eine Spannung von 60 V angelegt wurde, um die Proteine im Sammelgel zu sammeln. Anschließend wurde eine Spannung von 120 V für 90 min eingestellt, um die Proteine aufzutrennen.

3.4.4.2 Blotting

Für die Übertragung der Proteine von dem Gel auf die Nitrocellulosemembran (GE Healthcare Amersham Hybond-ECL) wurde das Gel in einer speziellen Kassette direkt auf die Membran gelegt und durch Blottingpapier und Kokosplatten geschützt. Diese Kassette wurde mit eiskaltem Blottingpuffer (siehe Anhang) gefüllt und durch Anlegen eines elektrischen Feldes (100 V für 1,5 h) wurden Proteine auf die Membran transferiert.

Um die gelungene Übertragung der Proteine auf die Membran zu überprüfen, wurde diese aus der Kassette entnommen und für 5 min mit Ponceau Rot-Lösung auf einem Schwenker

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inkubiert. Ein gleichmäßiges Bandenmuster konnte nach erfolgreicher Übertragung gesehen werden.

3.4.4.3 Gelfärbung und Vorarbeiten für die Massenspektrometrie

Für die Durchführung einer massenspektrometischen Untersuchung zur Überprüfung und Identifizierung der Proteinsequenz des equinen TRPV6 wurde ebenfalls ein Western Blot durchgeführt mit Ausnahme der Proteinübertragung auf eine Membran. Dabei wurden 25 µg der Proteinprobe von Pferd 07 und Pferd 09 (jeweils Duodenum und proximales Jejunum) 30 min bei 10 000 g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen und das entstandene Pellet mit 10 µl 1-2fach Hannover Puffer (5% DTT und 1% Proteaseinhibitor) sowie 1 µl Acrylamid versetzt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gel wurde anschließend über Nacht auf einem Schüttler in einer Coomassie-Färbelösung gefärbt um die Proteinbanden identifizieren zu können. Für eine verbesserte Identifikation und klarere Bandengebung wurde das Gel Stück für Stück bis zur gewünschten Bandenstärke anhand einer Färbelösung entfärbt. Anschließend wurde das Gel mit dem Gel Imager (ChemiDoc^TM BioRad, München) fotografiert, der gewünschte Bereich für die Sequenzierung ausgeschnitten und in ein 1,5 ml Probengefäß mit A. dest. überführt und zur Analyse weggeschickt.

3.4.4.4 Blockierung

Vor der Detektion der Zielproteine mittels spezifischer Antiköper wurden unspezifische Proteinbindestellen auf der Membran blockiert. Dies erfolgte durch Inkubation der Membran in Phosphate Buffered Saline with Tween (PBST) mit Magermilchpulver in verschiedenen Konzentrationen über Nacht bei 4 °C.

3.4.4.5 Immundetektion von Proteinen

Die Immundetektion der Zielproteine erfolgte im Anschluss an die Blockierung. Die für die jeweilige Detektion notwendigen Proteinmengen, Aufbereitungsschritte, Konzentrationen und Inkubationszeiten der verwendeten primären und sekundären Antikörper sind in Tabelle 8 und 9 beschrieben. Im Allgemeinen erfolgte nach der Blockierung zunächst ein Waschschritt, bei der das Magermilchpulver mit PBST abgespült wurde. Daraufhin erfolgte die Inkubation mit dem spezifischen Primärantikörper, gefolgt von mehreren Waschschritten mit PBST, um

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ungebundenen Antikörper von der Membran zu entfernen. Nach Inkubation mit dem Sekundärantikörper, der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP = Horseraddish Peroxidase) gekoppelt ist, erfolgte ein weiterer Waschschritt mit PBST. Zur Vorbereitung auf die Immundetektion wurde die Membran mit PBS und A. dest. gespült. Um die Proteinbanden zu detektieren wurde die Membran getrocknet und anschließend 5 min mit dem Substrat der Meerrettichperoxidase SuperSignal^® West Dura Extended Duration Substrat (Thermo Scientific, USA) inkubiert. Mit dem Gel Imager (ChemiDoc^TM BioRad, München) wurden die entstandenen Banden detektiert. Die Auswertung der Proteinbanden erfolgte mit der Quantifizierungssoftware ImageLab (Bio-Rad Laboratories, München), die die optische Dichte als Produkt der Fläche unter der Kurve (mm²) und der Pixeldichte in Form einer dimensionslosen Größe angibt.

Tabelle 8: Western Blot Analyse von PMCA und CaBPD9k, RT = Raumtemperatur, ß-ME = ß-Mercaptoethanol, DTT

= Dithiothreitol

PMCA (5F10 Santa Cruz) CaBPD9k (Cb9 Swant) Proteinmenge [µg] Gesamtmembran-Präparation ²⁰

10 Cytosol-Präparation

Proben- Bearbeitung

Zentrifugation 5 min, 10000 g Pellet versetzen mit 8 µl 1-2fach Denaturierungspuffer („Hannover“) + 10%

DTT

Zelllysat mit 2fach Lämmli+ 2% β-ME mischen Hitzedenaturierung 5min, 95°C

Elektrophorese SDS-PAGE 8,5%

60 V, 120 V,

Tricine-SDS-PAGE 16%

60 V, 150 V

Blotting Nitrocellulosemembran, 100 V, 90 min

Blockierung

ü.N. bei 4°C

in 5% Milch-PBST, abspülen PBS 1h, 10% Milch-PBST, abspülen PBST

Primär

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Tabelle 9: Western Blot Analyse von TRPV6, RT = Raumtemperatur

TRPV6 (ACC-036 Alomone labs)

Proteinmenge [µg] apikale Membran-Präparation ²⁵

Proben- Bearbeitung

Zentrifugation 5min, 10000 g Pellet versetzen mit 8 µl 1-2fach Denaturierungspuffer („Hannover“) +

in 5% Milch-PBST, abspülen mit PBST

Primär

Die Stärke des chemilumineszierenden Signals und damit die detektierbare Proteinmenge hängen von zahlreichen Faktoren, wie eingesetzter Proteinmenge und deren Integrität, ab. Um eine Vergleichbarkeit der Werte zu ermöglichen, ist deshalb eine Normalisierung notwendig.

Herkömmlich werden hierfür Houskeeping-Gene verwendet. Ein weiteres Verfahren ist die Normalisierung auf das aufgetragene Gesamtprotein. Dies kann, unter Verwendung von verschiedenen Farbstoffen wie zum Beispiel Indian Ink oder Ponceau-Rot, geschehen. Bei Ponceau-Rot wird die Membran direkt nach dem Blotten für 5 min in eine Gebrauchslösung überführt und inkubiert. Danach werden die Banden mit dem Gel Imager (ChemiDoc^TM BioRad) ausgewertet. Nach dem Auswaschen der Farbe mit PBST steht die Membran für die Antikörperdetektion zur Verfügung.

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Die Färbung mit „Indian Ink“ ist nicht reversibel und kann daher erst nach der Detektion erfolgen.