Spektroskopische Charakterisierung von ECD-PTHR2

Nachdem der native Zustand des ECD-PTHR2 belegt wurde, sollte im Folgenden die strukturelle Integrität und der Faltungszustand von ECD-PTHR2 untersucht werden. Die Ergebnisse können als Vergleichsdaten ECD-PTHR1 gegenüber gestellt werden. Dafür wurden Untersuchungen zur Charakterisierung der Sekundär- und Tertiärstruktur von ECD-PTHR2 durchgeführt.

UV-Absorption von ECD-PTHR2

Das UV-Absorptionsspektrum von renaturiertem und gereinigtem humanen ECD-PTHR2 zeigte ein charakteristisches Proteinspektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Minimum bei 250 nm (Abb. 3.28 A). Das Maximum und die leichte Schulter bei 290 nm werden durch die Absorption der vier Tryptophane ausgelöst, die das Protein-UV-Absorptionsspektrum gegenüber den zwei Tyrosin- und fünf Phenylalaninresten dominieren.

Fern-UV-CD-spektroskopische Untersuchung von ECD-PTHR2

Zur Analyse der Sekundärstruktur von ECD-PTHR2 wurden fern-UV-CD-spektros-kopische Untersuchungen für das native und das denaturierte Protein durchgeführt (Abb. 3.28 B). Das fern-UV-CD-Spektrum des rückgefalteten ECD-PTHR2 zeigte ein Hauptminimum bei 207 nm und ein leichtes Nebenminimum bei 230 nm. Die quantitative Abschätzung des Sekundärstrukturgehalts für natives ECD-PTHR2 erfolgte mit dem Programm CDPro/CONTINLL. Die Analyse über eine spektrale Breite von 200 nm bis 260 nm ergab einen α-helikalen Anteil von ca. 22 % und einen β-Faltblatt-Anteil von 24 %, sowie 33 % random coil. Die hier beobachtete Zusammensetzung der

Sekundär-C

strukturelemente von ECD-PTHR2 ist vergleichbar mit anderen Klasse B GPCR-Ectodomänen^{[67, 68]}. Fern-UV-CD-Spektren des denaturierten ECD-PTHR2 konnten wegen des starken Puffersignals von GdmHCl nur von 212 nm bis 260 nm aufgenommen werden.

Dabei entsprach das Spektrum des entfalteten ECD-PTHR2 dem einer vollständig entfalteten Polypeptidkette^[250-252]. Vergleicht man die Spektren des nativen und des denaturierten ECD-PTHR2, ist ein deutlicher Unterschied in den Wellenlängenbereichen von 220 nm bis 240 nm zu erkennen.

Fluoreszenzspektroskopische Untersuchung von ECD-PTHR2

Eine weitere charakteristische Eigenschaft von gefalteten Proteinen besteht in der Veränderung ihrer intrinsischen Tryptophanfluoreszenz, hinsichtlich Intensität und Wellen-länge des Emissionsmaximums, welche durch die Denaturierung ausgelöst wird. Um die Qualität und die Lösungsmittelexposition bzw. -umgebung der Fluorophore und der Tertiärstruktur von ECD-PTHR2 zu verifizieren, wurden Fluoreszenzemissionsspektren des nativen und denaturierten Proteins aufgenommen. Die N-terminale Domäne des PTH-Rezeptors 2 besitzt vier Tryptophan- und zwei Tyrosin-Aminosäurereste. Diese können genutzt werden, um konformationelle Informationen über ECD-PTHR2 bei Umgebungs-änderungen zu gewinnen. Deshalb erfolgte eine Anregung von Tyrosin- und Tryptophan-resten bei 280 nm (Abb. 3.29 A) und von TryptophanTryptophan-resten alleine bei 295 nm (Abb. 3.29 B). Das Emissionsmaximum lag in beiden Fällen für das native ECD-PTHR2 bei 341 nm und zeigte eine Rotverschiebung von 9 nm für das denaturierte Protein bei 350 nm. Die Fluoreszenzintensität des denaturierten ECD-PTHR2 zeigte bei einer Anregungswellenlänge von 280 nm eine 55%ige Zunahme im Vergleich zum nativen Zustand. Wenn die Tryptophanseitenketten eines Proteins im Lösungsmittel exponiert sind, liegt das Emissionsmaximum bei 350 nm, während eine hydrophobe Einbettung von Tryptophanresten zu Emissionsmaxima mit weitaus kürzeren Wellenlängen von 320 nm bis 340 nm führen^[250]. Das hier beobachtete Emissionsmaximum für natives ECD-PTHR2

Abbildung 3.28: UV-Absorptions- und CD-Spektrum des gereinigten ECD-PTHR2. A: Das UV-Absorptionsspektrum wurde in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 gemessen. Die Messtemperatur lag bei 23 °C. Das Proteinspekturm wurde um den Beitrag des Pufferspektrums korrigiert. B: Sekundär-strukturanalyse des nativen und des denaturierten ECD-PTHR2 mittels fern-UV-CD-Spektroskopie.

Spektren des nativen ECD-PTHR2 (schwarz) wurden in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 und Spektren für denaturiertes ECD-PTHR2 (rot) in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 6 M GdmCl, pH 7,5 gemessen. Die Proteinkonzentration betrug 25 µM. Die Messtemperatur lag bei 20 °C. Alle Spektren wurden 25fach akkumuliert und um den Beitrag des jeweiligen Pufferspektrums korrigiert. .

A

B

von 341 nm liegt an der Grenze einer hydrophoben Einbettung von Tryptophan und weist auf eine partielle Exposition von aromatischen und hydrophoben Aminosäureseitenketten hin. Sie sind nicht vollständig im Inneren des Proteins verborgen. Die partielle Exposition kann aber mit dem fragmentarischen Charakter der renaturierten extrazellulären Domäne des PTHR2 erklärt werden, wie es schon für ECD-PTHR1 beobachtet wurde^[67]. Aufgrund dieses Domänencharakters kann ECD-PTHR2 wahrscheinlich nur eine partielle Strukturierung ausbilden.

ANS-Bindungsstudien an ECD-PTHR2

Um in einem weiteren Schritt die partielle Exposition von hydrophoben Aminosäure-seitenketten zu charakterisieren, wurde eine klassische Interaktion von ECD-PTHR2 mit dem hydrophoben Farbstoff 8-Anilino-1-Naphtalensulfonat (ANS) untersucht. Durch die Bindung der unpolaren Anilino-Naphtalengruppe an hydrophobe Oberflächen von Proteinen ändert ANS seine Fluoreszenzeigenschaften^{[254, 255]}. Als Ergebnis der Bindung sind eine Verschiebung des Emissionsmaximums und ein Anstieg der Fluoreszenz-intensität zu beobachten, sobald sich der Farbstoff in einer unpolaren Umgebung befindet.

Diese Umgebung findet man vor allem in den hydrohoben Regionen, die in einem partiell strukturierten Protein wie ECD-PTHR2 vorliegen. In wässriger und nicht protein-gebundener Umgebung wird die Fluoreszenzemission des ANS-Moleküls wirkungsvoll durch die Lösungsmittelmoleküle gelöscht^[256]. Mit ANS-Bindungsstudien konnte auch der partiell hydrophobe Charakter von ECD-PTHR1 nachgewiesen werden^[254].

In Abbildung 3.30 A und B sind die Fluoreszenzemissionsspektren des renaturierten und in Abbildung 3.30 C und D des denaturierten ECD-PTHR2 in Gegenwart von ANS und als Referenz ANS in Abwesenheit von ECD-PTHR2 gezeigt. ANS wurde in einem 100-fach molaren Überschuss, zum eingesetzten Protein gegeben. Die Anregung erfolgte bei 350 nm für ANS und 280 nm für das Protein. Die Fluoreszenzemissionsspektren von nativem ECD-PTHR2 mit ANS und ANS allein zeigen deutliche Unterschiede.

Wellenlänge (nm)

320 340 360 380 400 420

relative Fluoreszenzintensität

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Wellenlänge (nm)

320 340 360 380 400 420

relative Fluoreszenzintensität

0 20 40 60 80

Abbildung 3.29: Fluoreszenzemissionsspektren von nativem und denaturiertem ECD-PTHR2. Die Spektren des nativen ECD-PTHR2 (schwarz) wurden in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 und die Spektren für denaturiertes ECD-PTHR2 (rot) in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 6 M GdmCl und pH 7,5 aufgenommen. Die Proteinkonzentration betrug 1 µM. Die Messtemperatur lag bei 20 °C. Alle Spektren wurden 3fach akkumuliert. A: Fluoreszenzemissionsspektren von ECD-PTHR2 bei einer Anregungs-wellenlänge von 280 nm. B: Fluoreszenzemissionsspektren von ECD-PTHR2 bei einer Anregungs-wellenlänge von 295 nm.

A B

Für beide Anregungswellenlängen (280 nm in Abb. 3.30 A und 350 nm in Abb. 3.30 B) zeigt das Emissionsmaximum von ANS, in Gegenwart von nativem ECD-PTHR2, eine Intensitätssteigerung und Verschiebung. Bei einer Anregung von 280 nm verschiebt sich das Maximum von 520 nm auf 477 nm und zeigt eine Intensitätssteigerung um den Faktor drei. Bei einer Anregung von 350 nm zeigt das Emissionsspektrum eine Intensitäts-steigerung um den Faktor 2,5 und ein verschobenes Emissionsmaximum von 525 nm auf 483 nm. Diese Differenz zwischen Fluoreszenzintensität und Emissionsmaximum lässt darauf schließen, dass eine Bindung von ANS an hydrophobe Bereiche von ECD-PTHR2 und somit eine Interaktion stattgefunden hat. Der Vergleich der Emissionsspektren von ECD-PTHR2 mit ANS und ANS allein unter denaturierenden Bedingungen (6 M GdmCl) zeigt, dass die Interaktion mit ANS weitestgehend unterbunden wird. Bei einer Anregung mit 280 nm und 350 nm für ANS in An- und Abwesenheit von ECD-PTHR2 sind nur marginale Unterschiede für die Fluoreszenzintensität und das Emissionsmaximum, zu erkennen. Die gemessenen Fluoreszenzemissionsspektren deuten darauf hin, dass exponierte hydrophobe Bereiche in Form von Aminosäureseitenketten im renaturierten

Wellenlänge (nm)

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

relative Fluoreszenzintensität

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Wellenlänge (nm)

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

relative Fluoreszenzintensität

0 20 40 60 80 100 120 140

Wellenlänge (nm)

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

relative Fluoreszenzintensität

0 20 40 60 80 100 120

Wellnlänge (nm)

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

relative Fluoreszenzintensität

0 20 40 60 80 100

Abbildung 3.30: ANS-Bindungsstudien des nativen und denaturierten ECD-PTHR2. A und B:

Fluoreszenzemissionsspektrum von 100 µM ANS in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 und Abwesenheit von nativem ECD-PTHR2 (rot). Fluoreszenzemissionsspektrum von ANS in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 und Gegenwart von 1 µM nativem ECD-PTHR2 (schwarz). A:

Anregungswellenlänge 280 nm. B: Anregungswellenlänge 350 nm. C und D: Fluoreszenzemissions-spektren von 100 µM ANS in 6 M GdmCl, 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 und Abwesenheit von ECD-PTHR2 (rot). Fluoreszenzemissionsspektrum von ANS in 6 M GdmCl, 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 und Gegenwart von 1 µM denaturiertem ECD-PTHR2 (schwarz). C: Anregungs-wellenlänge 280 nm. D: AnregungsAnregungs-wellenlänge 350 nm. Die Messtemperatur lag bei 20 °C. Alle Spektren wurden 10fach akkumuliert.

A B

C D

ECD-PTHR2 vorlagen und nicht alle im Inneren der Domäne eingebettet waren. Da mit ECD-PTHR2 nur die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne des PTH-Rezeptors 2 her-gestellt wurde, ist es wahrscheinlich, dass das Protein partielle Strukturierungen mit freiliegenden hydrophoben Bereichen und Aminosäureseitenketten zeigt. Die N-terminale Domäne des PTH-Rezeptors 2 zeigte in diesem Zusammenhang vergleichbare Eigen-schaften hinsichtlich hydrophober Oberflächenstrukturen wie ECD-PTHR1^[254].

Untersuchung des Faltungszustandes von ECD-PTHR2 mittels 1D-¹ H-NMR-Spektroskopie

Zur weiteren Charakterisierung der Tertiärstruktur und des Faltungszustandes von ECD-PTHR2 wurde ein Protonen-NMR-Spektrum (1D-¹H-NMR-Spektrum) aufgenommen (Abb. 3.31). Das Spektrum zeigt eine gute Dispersion der Amidprotonen (6-10 ppm) und der aliphatischen Seitenketten (-1 bis 1 ppm). Ein oligomerer Zustand für ECD-PTHR2 kann ausgeschlossen werden, denn dieser hätte eine stärkere Verbreiterung der Signale in diesen Bereichen zur Folge. Es kann auch davon ausgegangen werden, dass das Protein in einer gefalteten Struktur vorlag, in der die Methyl- und Amidprotonengruppen in eine definierte Tertiärstruktur eingebunden waren. Das Fehlen eines ausgeprägten Protonen-signals der Tryptophanseitenketten, bei einer chemischen Verschiebung von ca. 10 ppm, ist ein guter Hinweis, dass die Tryptophane im Inneren des Proteins lokalisiert sind. Eine Lösungsmittelexposition des Amidprotons des Tryptophan-Indolrings hätte sonst ein deutliches Signal an dieser Stelle zur Folge. Das bestätigt auch die Ergebnisse der fluoreszenzspektroskopischen Charakterisierung. Die Protonenresonanzen im Bereich von 0 ppm werden meist durch Methylprotonen im Inneren eines Proteins hervorgerufen und sind dadurch ein zusätzlicher Hinweis, dass EDC-PTHR2 unter den gewählten Mess-bedingungen in einer gefalteten, strukturierten und kompakten Form vorlag.

Abbildung 3.31: 1D-¹H-NMR-Spektrum von ECD-PTHR2.

Für die Aufnahme des Spektrums wurde 15 µM ECD-PTHR2 in 50 mM NaH2PO4, 300 mM Na2SO4, 0,02 % NaN3, 10 % D2O (v/v) und pH 7,5 bei 25 °C verwendet. Das Spektrum wurde an einem Bruker Avance III 600 MHz NMR-Spektro-meter aufgenommen.