Vorgehensweise zur Ermittlung der Biokompatibilität

Da Zellversuche unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen, ist eine voran-gestellte Sterilisierung der Proben und verwendeten Materialien nötig. Die gereinigten und beschichteten Proben werden mittels trockene Hitze, drei Stunden bei 200^◦C im Wärmeschrank Typ FED 240 (Firma Binder GmbH, Deutschland) sterilisiert. Um nur den Einfluss der Oberflächenbeschichtung auf die Zellkultur zu testen, werden Silikonnäpfchen als Zellkulturgefäße verwendet, siehe Abschnitt 3.2.2. Diese werden bei 121^◦C autoklaviert. Die getemperten, abgekühlten Proben werden anschließend unter der Laminar Flow in die Näpfchen mittels Pinzetten gelegt. Die Näpfchen sind so konzipiert, dass sie passgenau mit den Proben abschließen und somit ein Unterlaufen der Flüssigkeit ausgeschlossen ist.

3.4.3.1 Eluattests

Bei dem Eluattest wird das Lösen von toxischen Substanzen aus der Beschichtung mittels CCK-8 Test evaluiert.

Um die Eluate anzusetzen, werden die beschichteten und sterilisierten Prüfkörper in Näpfchen gelegt. Es werden immer negative und positive Kontrollproben sowie eine Referenz mitgeführt. Als Positivkontrolle dienen hierbei leere runde Silikonnäpfchen, da Silikon bioinert ist. Als negativ Kontrolle dienen Kupferplättchen aus einem Kupferblech. Als Referenz dienen Wells einer 12er-Wellplatte. Auf die Proben wird die nach DIN EN ISO 10993-12, siehe Tabelle 3.4, berechnete Menge an Medium gegeben um Eluate herzustellen und anschließend werden die Proben für 72 Stunden bei 37^◦C und 8% CO₂ inkubiert. 24 Stunden vor Ende der Inkubation werden in einer 96-Wellplatte pro Probe ein Well mit 5000 Zellen/cm²Hs27 besiedelt und inkubiert. Nach Verstreichen der 72 Stunden Inkubation der Eluate werden diese auf die in 96er Wells angesetzten Zellen gegeben. Hierfür wird zuerst das alte Medium abgesaugt und anschließend das Eluat darauf gegeben. Die beimpften Zellen werden erneut für 72 Stunden in den Inkubator gestellt. Nach der Inkubation wird das alte Medium von den Zellen entfernt und es werden zehn Teile Medium mit einem Teil CCK-8 Lösung gemischt und auf die Zellen gegeben. Nach einer Stunde im Inkubator kann der Farbumschlag der CCK-8 Lösung mittels Photometer bestimmt werden.

42 3 Herangehensweise und Untersuchung der plasmabeschichteten Oberflächen

Probe Edelstahl Silikon

(negativ Probe)

Kupfer

(positiv Probe)

Grundfläche [cm²] 1 0,636 1

Extraktionsverhältnis [cm²/mL]

3 3 6 (Blech)

Menge an Medium [µL] 333 212 167

Tabelle 3.4: Extraktionsverhältnis zur Zytotoxizitätsbestimmung nach DIN EN ISO 10993-12

3.4.3.2 Direkte Besiedlungsversuche

In diesem Fall wird auch mit dem CCK-8 Test die Zellvitalität bestimmt, jedoch diesmal nicht über Eluate, sondern direkt auf der Oberfläche. Die Silikonnäpfchen mit den eingelegten, beschichteten Prüfkörpern werden mit 5000 Zellen/cm² beimpft. Hierfür werden entweder Zellen der Zelllinie Saos-2 oder der Zelllinie HS27 verwendet. Die Wells werden auf 333µL mit Zellkulturmedium (DMEM für Hs27 und Mc Coys 5A für Saos-2) aufgefüllt und dann im Inkubator bei 37^◦C und 8% CO₂ für vier Tage inkubiert. Im nächsten Schritt wird das Zellkulturmedium abgezogen und mit 333µL pro Näpfchen einer 10:1 Mischung aus Zellkulturmedium und CCK-8 Lösung ersetzt.

Dies wird anschließend für eine Stunde inkubiert. Danach werden aus jeder Probe 100µL in eine 96er Wellplatte überführt. Die Proliferation der Zellen wird mittels photometrischer Messungen bestimmt.

3.4.3.3 Morphologische Untersuchungen der Zellen mittels REM

Zur Untersuchung der Morphologie der Zellen (Hs27 oder Saos-2) auf der Beschichtung werden die Proben in Silikonnäpfchen gelegt und anschließend mit 4000 Zellen/cm² beimpft und für vier Tage bei 8% CO₂ und 37^◦C inkubiert. Anschließend werden die Zellen mit PBS gewaschen, um tote Zellen und Mediumrückstände zu entfernen. Auf die Zellen werden 333µL einer 3%igen Glutaraldehydlösung zur Fixierung gegeben und für weitere drei Tage bei 4^◦C gelagert. Nach dem Fixieren der Zellen müssen diese getrocknete werden. Hierfür wird eine aufsteigende Alkoholreihe auf die Zellen gegeben, siehe Abbildung 3.9. Nach der Alkoholreihe werden die Zellen mit 99%igem Alkohol für 24 Stunden im Kühlschrank inkubiert und anschließend werden die Proben im Exsikkator getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Proben mit Gold besputtert und mittels REM analysiert.

3.4 Biokompatibilitätsuntersuchungen der Schicht 43

Abbildung 3.9: Vorgehen zur Trocknung der Zellen mittels Alkoholreihe

3.4.3.4 Morphologische Untersuchungen der Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Unter Fluoreszenz wird die Absorption von kurzwelligem Licht und anschließende Emit-tierung von längerwelligem charakteristischem Licht verstanden [101]. Um die Morpholo-gie von Zellen auf Substratoberflächen darzustellen, kann die Calcein-Fluoreszenzfärbung angewandt werden. Bei dieser wird Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM), ein nicht fluoreszierender, ungiftiger und zellwandpermeabler Stoff, zu den Zellen gegeben [102].

In lebenden Zellen wird der AM Rest im Zytoplasma unspezifisch von mitochondriellen Enzymen (Esterasen) abgespalten [103]. Dadurch wird das Calcein-AM in das stark fluoreszierende Calcein umgewandelt, welches nicht zellpermeabel ist und daher lebende Zellen nicht passieren kann [104]. Calcein besitzt ein Emissionsmaximum bei 530 nm und ein Anregungsmaximum bei 485 nm [104].

Um die Morphologie der Zellen (Hs27) auf den plasmabeschichteten Probenkörpern zu detektieren, werden diese in Silikonnäpfchen mit einer Zelldichte von 3500 Zellen/cm³ besiedelt und für fünf Tage bei 37^◦ und 8% CO₂ inkubiert. Anschließend wird das alte Zellkulturmedium (DMEM) abgezogen und mit einer, mittels DMEM verdünnten Calceinlösung (DMEM:Calcein, 2000:1) ersetzt. Darauf erfolgt eine 15-minütige Inkuba-tion und danach wird die verdünnte Calceinlösung abgezogen und die Zellen werden drei Mal mit PBS gewaschen. Des Weiteren wird auf ein Objektträgerglas ein Tropfen PBS gegeben und die besiedelten Plättchen werden mit der Beschichtung nach unten auf diesen Tropfen gelegt. Nach dieser Präparation müssen die Zellen direkt mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden.

44 3 Herangehensweise und Untersuchung der plasmabeschichteten Oberflächen