Vorbereitung der Titrationsexperimente mit den cytoplasmatischen Domänen von K v 1.4

Nachdem die Zuordnung der Kv1.4 T1 Domäne erfolgt und abgesichert war, konnten Titrationsexperimente zur Untersuchung der Interaktionen der T1 Domäne mit dem K_v1.4 Inaktivierungspeptid und dem ebenfalls cytosolischen C-Terminus geplant und vorbereitet werden. Das Inaktivierungspeptid selbst war bereits in der Arbeitsgruppe von Prof. Bernd Fakler, Uni Freiburg, untersucht und charakterisiert worden und stand daher zur Verfügung.

Ein Konstrukt des Kv1.4 C-Terminus wurde von Doris Wiedemann (Wiedemann 2005) im Rahmen einer Diplomarbeit kloniert.

3.2.5.1 Das K

1.4 IP Konstrukt

Bei dem verwendeten Kv1.4 IP Konstrukt handelt es sich um das Konstrukt, das der 2003 von R. Wissmann und B. Fakler veröffentlichten Struktur der sogenannten Tandem-Inaktivierungsdomäne (Wissman, Fakler 2003, PDB 1KN7) zu grunde liegt. Es besteht aus den ersten 75 AS des K_v1.4 Proteins. Das Konstrukt besitzt zwei helikale Segmente (AS 20 bis AS 38 und AS 40 bis AS 50), die über einen flexiblen Linker verbunden sind, einen ungefalteten N- und einen sehr flexiblen und glycinreichen C-Terminus.

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Abb. 3.16: Das Kv1.4 IP Konstrukt umfasst die ersten 75 AS des Kv1.4 Kanalproteins. Das Konstrukt trägt am N-Terminus drei zusätzliche Aminosäuren, die den Überhang der Thrombinschnittstelle darstellen. Die beiden α-helikalen Sekundärstrukturelemente sind entsprechend markiert. Das Konstrukt hat einen theoretischen pI von 7,04 bei einer molaren Masse von 7,79 kDa.

Eine ¹⁵N-markierte Probe des Peptids für die Titration mit dem T1K Konstrukt konnte von der Arbeitsgruppe von Prof. Fakler, Freiburg, zur Verfügung gestellt werden. Weiteres unmarkiertes Material für die weiteren Titrationsexperimente musste jedoch in gößerer Menge exprimiert werden. Dazu wurden die Expressions und Aufreinigungsbedingungen des Konstrukts überprüft, an die veränderten Pufferbedingungen angepasst und anschließend optimiert.

Das Konstrukt lag in dem Vektor pET41a (Novagen) vor, besaß also N-terminal einen 6xHis- und GST-Tag. Der ebenfalls im Plasmid codierte S-Tag war bei der Klonierung entfernt worden. Aufgrund der relativ geringen Expression im ursprünglich verwendeten E. coli BL21(DE3) Expressionsstamm wurde zunächst aufgrund der bisherigen guten Erfahrungen mit Kaliumkanalkonstrukten von Säugetieren, das Expressionsplasmid isoliert und in den bereits zuvor verwendeten E. coli Expressionsstamm Rosetta^TM pLysS transformiert. Da dieser Stamm die bei mammaler DNA häufig auftretenden, bei E. coli aber seltenen Codons durch zusätzliche tRNAs komplementiert, konnte so die Expression deutlich gesteigert werden.

Das ursprüngliche Aufreinigungsprotokoll sah eine zweistufige Aufreinigung über die beiden Affinitäts-Tags mit anschließendem Thrombinverdau zur Entfernung des gesamten Tags vor.

Dazu musste das Protein jedoch mehrfach umgepuffert werden. Insgesamt zeigten sich bei der Durchführung des Protokolls relativ große Proteinverluste, vermutlich auch durch Oxidation, und ein hoher Zeitaufwand. Eine Überprüfung des Pellets des Aufschlusses zeigte zudem, dass ein relativ großer Anteil des exprimierten Proteins in Einschlusskörperchen (Inclusion Bodies) vorlag. Daher wurde der Versuch einer denaturierenden Reinigung analog zu den weiteren Konstrukten über eine Ni-NTA Matrix unternommen. Die anschließende Rückfaltung erfolgte direkt in einen Puffer (150 mM KP_i, 20 mM DTE, pH 7,3) der sowohl die Stabilität des Proteins als auch die Aktivität der für die anschließende Entfernung des Tags eingesetzten Thrombinprotease gewährleistete. Es konnte eine Rückfaltausbeute von 80%

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erreicht werden. Bei dem ausgefallenen Protein handelte es sich größtenteils um Verunreinigungen, die bei der Affinitätsreinigung noch nicht entfernt werden konnten, aber unter den Bedingungen der Rückfaltung nicht löslich waren. Nach dem Thrombinverdau erfolgte die Nachreinigung und Entfernung von Tag und Thrombin über eine Gelfiltration mit einer Superdex 75 Matrix (GE Healthcare). Dabei wurde gleichzeitig auf den KPi

Standardpuffer (150 mM KP_i, pH 6,5) mit zusätzlich 20 mM DTE als Reduktionsmittel umgepuffert. Da das Thrombin vollständig entfernt werden konnte, konnte auf die ursprünglich vorgesehenen Proteaseinhibitoren verzichtet werden.

Das neue Aufreinigungsprotokoll erwies sich als deutlich effektiver als das bisher verwendete. Durch den Wegfall der Aufreinigung über die GSH Säule sinken auch die Kosten der Aufreinigung. Das K_v1.4 IP Konstrukt stand nun in ausreichender Menge und gleichbleibend guter Qualität zur Verfügung.

Gleichzeitig wurde das Assignment des K_v1.4 IP von R. Wissmann, basierend auf ¹⁵N HSQC Spektren (aufgenommen bei pH 4,4) mit den unter den adaptierten Pufferbedingungen aufgenommenen ¹⁵N TROSY HSQC-Spektren abgeglichen. So konnte die vorhandene Zuordnung auf die veränderten Meßbedingungen übertragen werden. Erwartungsgemäß zeigten sich im Bereich der Signale der Histidine H61-H64 durch die Deprotonierung der Histidinreste deutliche Veränderungen der Verschiebungen in H-Richtung. Die übrigen Signale konnten unter Berücksichtigung der relativ geringen systematischen Veränderungen, die durch die unterschiedlichen Spektren bedingt waren, problemlos identifiziert werden.

3.2.5.2 Das K

1.4 C-Terminus Konstrukt

Die Klonierung des K_v1.4 C-Terminus wurde von Doris Wiedemann im Rahmen ihrer Diplomarbeit durchgeführt (Wiedemann 2005). Das Konstrukt mit der besten Löslichkeit zeigte auffallend ähnliche Lösungsbedingungen wie das zuvor klonierte T1K Konstrukt der T1 Domäne: 150 mM KP_i bei pH 6,5, zusätzlich wurden 20 mM DTE eingesetzt, da das Konstrukt Cysteine enthält, die die Bildung von Dimeren durch Disulfidbrücken ermöglichen.

Diese Dimere waren im Gelfiltrationsschritt der Aufreinigung nachweis- und entfernbar.

Die Aufreinigung des mit Hilfe des pET 19b Plasmids in E.coli Rosetta^TM pLysS exprimierten Konstrukts erfolgte denaturierend (vgl. T1K Konstrukt) über den hier N-terminalen 10xHis-Tag. Die ebenfalls enthaltene Enterokinase-Schnittstelle, die eine Entfernung des Tags ohne Überhang-Aminosäuren ermöglichen sollte, erwies sich als unbrauchbar. Die erforderlichen Verdaubedingungen (mindestens pH 7,5, phosphatfreier Puffer) führten zur Präzipitation des Proteinkonstrukts. Zusammen mit dem 10xHis-Tag und der Linkersequenz mit der

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Enterokinase-Schnittstelle hat das Konstrukt eine molare Masse von 12,8 kDa. Da das Konstrukt den C-Terminus in einer Länge von 84 AS (E571 bis V655) umfasst, erhielt es die Bezeichnung Kv1.4 C84 oder kurz C84.

MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMETENEEQTQLTQ

NAVSCPYLPSNLLKKFRSSTSSSLGDKSEYLEMEEG VKESLRGKEEKCQGKGDDSETDKNNCSNAKAVETDV

Abb. 3.17: Das K_v1.4 C84 Konstrukt ist insgesamt 108 AS lang mit einer molaren Masse von 12,8 kDa. Die rot markierte Sequenz besteht aus dem 10xHis-Tag und der Enterokinaseschnittstelle, blau markiert ist das hochkonservierte C-terminale PDZ-Bindemotiv, dessen Funktionalität in NMR- Titrationsexperimenten nachgewiesen werden konnte (Meyer 2005)

Das Konstrukt beginnt direkt nach dem Ende der S6 Helix, und damit der Transmembran-Domäne. Verschiedene Sekundärstruktur-Vorhersageprogramme ergaben mehr oder weniger lange helikale Strukturen im Bereich der unmittelbar auf die S6 Helix folgenden Sequenzbereiche.

Nach dem erfolgten sequentiellen Assignment des Konstrukts durch Simon Meyer (Meyer 2005, Diplomarbeit) konnten jedoch keine Hinweise auf stabile Sekundärstrukturelemente gefunden werden.

3.2.5.3 Erstellung eines Homologiemodells für das K

1.4 T1 Tetramer

Um die Ergebnisse der geplanten Titrationsexperimente besser beurteilen zu können, und um eine bessere Nutzung der durch das sequentielle Assignment gewonnenen Informationen zu gewährleisten, war eine räumliche Darstellung des K_v1.4 T1K Konstrukts erforderlich. Da die für die Strukturrechnung notwendigen NMR-Daten aufgrund der Größe des Tetramers noch nicht ausreichten (keine NOE-Kontakte), wurde ein Homologiemodell erstellt. Dieses Homologiemodell basiert auf der Kristallstruktur des Tetramers der Kv1.2 T1 Domäne, die von Minor et al. gelöst wurde (Minor, Berger 2000; PDB 1QDV). Diese Struktur mit einer Auflösung von 1,6 Å wurde als Vorlage verwendet, da sie über eine zu 88%

identische Sequenz verfügt. Bei den abweichenden AS handelt es sich um konservative Mutationen, die meist einzeln auftreten. Eine sehr ähnliche Tertiär- und Quartärstruktur ist daher anzunehmen. Das Alignment ist im Anhang dargestellt.

Mit Hilfe der Homology-Modeling-Wizzard Funktion von Auremol^TM (Gronwald & Kalbitzer 2004) wurden die für die eigentliche Modellrechnung in CNS (Brünger 1998) erforderlichen Alignment-Files erstellt. Nach der anschließenden CNS-Rechnung wurden die

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energieärmsten Modellstrukturen identifiziert und mit Hilfe von MolMol^TM dreidimensional dargestellt.

← C

↓ N

← N

C →

Abb. 3.18: Homologiemodell des Kv1.4 T1K Konstrukts. Das Modell beruht auf der Kristallstruktur der Kv1.2 T1 Domäne (Minor, Berger 2000; PDB 1QDV). Diese Struktur mit einer Auflösung von 1,6 Å ist zu 88% sequenzidentisch mit dem K_v1.4 T1K Konstrukt. MolMol-Darstellung als Ribbon-Modell. Zur Orientierung sind N- und C-Termius markiert. Der zum Cytosol ausgerichtete N-Terminus ist gemäß der Konvention nach unten orientiert. Die typischen Strukturelemente einer T1 Domäne mit dem N-terminalen antiparallelen ß-Faltblatt und dem ausschließlich α-helikalen C-N-terminalen (membranzugewandten) Bereich sind deutlich erkennbar.

3.2.6 Titrationsexperimente: Interaktionen von K

1.4 T1K mit den cytosolischen