Volumenexpansionsversuche

In den vorhergehenden Versuchen wurde gezeigt, dass WT als auch KO nach Wasserentzug eine vergleichbare Diurese sowie Ionen-Ausscheidung aufweisen und augenscheinlich den AQP2-Einbau in die Plasmamembran bei der forcierten Urinaufkonzentrierung gleichermaßen regulieren können. Bei den den nachfolgenden Versuchen wurde untersucht, ob ein Fehlen der cGKII die Osmo- bzw. Volumenregulation beeinflusst. Hierzu wurde WT- bzw. cGKII-KO-Tieren mittels Schlundsondierung eine hypertone, isotone sowie hypotone Lösung verabreicht und nachfolgend zunächst Volumen und Ionenkonzentrationen des im Stoffwechsel-Käfig gesammelten Urins bestimmt.

C.3.2.1 Vorversuch

Bevor die eigentlichen Versuche gestartet wurden, wurde zuerst ein Vorversuch durchgeführt, in dem die optimale Menge an appliziertem Volumen ermittelt wurde. Hierzu wurde WT-Mäusen entweder die Schlundsonde eingeführt, ohne eine Lösung zu applizieren (sham-Kontrolle: N=10), oder 3% vom Körpergewicht (BW) einer 10mM Glucose-Lösung (Water Load (WL) 3% v. BW:

N=10) bzw. 2 x 3% vom KG der gleichen Lösung mit einstündigem Abstand (WL 2 x 3% v. BW:

N=4) appliziert. Der Urin wurde über einen Zeitraum von 6h gesammelt und anschließend das U

alle

rin-Volumen gemessen (vgl. Abb. 18). Es zeigte sich, dass das Urin-Volumen bereits bei der einmaligen Applikation von 3% v. BW dieser Lösung höchst signifikant gesteigert wird, so dass

nachfolgenden Versuche unter dieser Bedingung durchgeführt wurden.

°°°

-Menge in Abh. des applizierten Volumens

en nach 6h Sammelzeit, N=4-10, wie in Säulen angegeben. Weitere Erklärungen siehe Text.

C.3.2.2 Verabreichung einer isotonen Lösung (Volumenregulation)

Während einer Hypervolämie wird vermehrt ANP aus den Atrien ausgeschüttet, das letztlich zu einer verstärkten Diurese und Natriurese führt. Um zu überprüfen, ob die cGKII an der Regulation dieser Prozesse beteiligt ist, wurde WT- und KO-Mäusen 0,9% NaCl-Lösung verabreicht und Diurese sowie Natriurese innerhalb der folgenden 6h analysiert. Abb. 19 veranschaulicht die erhaltenen Werte. Wie erwartet stiegen Urin-Volumen und Natrium-Ausscheidung im WT signifikant an, eine analoge Steigerung konnte ebenfalls beim cGKII-KO beobachtet werden.

Zwar erschienen die Natrium-Molmengen nach Induktion der Hypervolämie im Urin von KO-Tieren im Vergleich zum WT tendenziell erniedrigt, dieser Unterschied erreichte jedoch keine statistische Signifikanz.

Abb. 19: Urin-Volumen und Natrium-Molmengen nach Verabreichung einer isotonen Lösung Schlundsondierung mit 3% des Körpergewichts einer 0,9% NaCl-Lösung, als Kontrollen wurden sham-behandelte

Tiere verwendet. Gesammelter Urin wurde nach 6h bezüglich Urin-Volumen (links) und Natrium-Exkretion (rechts) analysiert, N=7-12, wie in Säulen angegeben. UNa⁺V: Na⁺-Exkretion, BW: Körpergewicht. Weitere

C.3.2.3 Verabreichung einer hypertonen Lösung (Osmoregulation, Salt Load)

Nachdem zunächst die Volumenregulation bezüglich Diurese und Natriurese im cGKII-KO untersucht wurde, sollte nachfolgend die Osmoregulation im Fokus stehen. Um eine Hypertonie des Serums hervorzurufen, wurde den Mäusen in Analogie zu den Hoch-Salz-Diäten per Schlundsonde eine 4%-ige Kochsalz-Lösung appliziert. Wie in Abb. 20 gezeigt (WT sham: N=12, WT 4% NaCl: N=4, KO sham: N=12, KO 4% NaCl: N=4), reagierten WT und KO auf diesen Salt-Load gleichermaßen mit einer um das 2,5-fache erhöhten Diurese sowie einer um das 9-fache erhöhten Natriurese, Unterschiede zwischen den Genotypen bzgl. der analysierten Parameter konnten nicht detektiert werden.

WT sham

Verabreichung einer hypotonen Lösung (Osmoregulation, Water

ng (WT sham: N=12, WT WL: N=14, KO sham: N=12, KO WL: N=14). Wie erwartet, stieg die Diurese im WT nach WL signifikant an. Im cGKII-KO war im Vergleich zur sham-Kontrolle ebenfalls eine signifikante Zunahme der Diurese zu beobachten, allerdings war diese Zunahme im KO, verglichen mit dem WT, signifikant schwächer ausgeprägt 20: Urin-Volumen und Natrium-Molmengen nach Verabreichung einer hypertonen Lösung Schlundsondierung mit 3% des Körpergewichts einer 4% NaCl-Lösung, als Kontrollen wurden sham-behandelte

Tiere verwendet. Gesammelter Urin wurde nach 6h bezüglich Urin-Volumen (links) und Natrium-Exkretion (rechts) analysiert, N=4-12, wie in Säulen angegeben. UNa⁺V: Na⁺-Exkretion, BW: Körpergewicht. Weitere

Erklärungen siehe Text.

C.3.2.4 Load)

Schließlich wurde eine forcierte Urin-Verdünnung nach Volumenexpansion herbeigeführt, indem den Mäusen eine 10mM Glucose-Lösung per Schlundsonde appliziert und somit eine Hypoosmolalität des Serums herbeigeführt wurde. Abb. 21 demonstriert die Diurese bzw.

Natriurese unter dieser gewählten Bedingu

Um das überschüssige Wasser-Volumen aus dem Organismus wieder auszuscheiden, wird der luminale Membran-Einbau von AQP2 in den Sammelrohren unterbunden. Die im Vergleich zum WT verminderte Diurese in cGKII-KO-Mäusen lieferte einen ersten Hinweis auf eine mögliche Beteiligung der cGKII an der Hemmung des AQP2-Membran-Transports, so dass im Folgenden eine detailliertere Analyse durchgeführt wurde (siehe C.3.3, S.70). Neben der Diurese zeigten cGKII-KO-Tiere im Rahmen der hypoosmolaren Volumenexpansion ebenfalls eine veränderte Natriurese. Im WT führte die Schlundsondierung mit hypotoner Lösung zu keiner Änderung der Natriumausscheidung. Auch im KO blieb die Natriurese vergleichbar mit der der sham-Kontrollen, allerdings schieden die cGKII-KO-Mäuse sowohl unter Kontroll-Bedingungen als auch unter WL-Bedingungen, verglichen mit dem WT, nur 66% Natrium aus. Auch dieser Befund sollte nachfolgend näher charakterisiert werden.



breichung einer hypotonen Lösung mM Glucose-Lösung, als Kontrollen wurden sham-esammelter Urin wurde nach 6h bezüglich Urin-Volumen (links) und

Natrium-, N=12-14Natrium-, wie in Säulen angegeben. Signifikante Unterschiede sind mit °

+ V (BW)/6h]

12 14 12 14

[µ

Abb. 21: Urin-Volumen und Natrium-Molmengen nach Vera Schlundsondierung mit 3% des Körpergewichts einer 10

behandelte Tiere verwendet. G Exkretion (rechts) analysiert

gekennzeichnet (ANOVA, °: p<0,05, °° p<0,01, °°° p<0,001). UNa⁺V: Na⁺-Exkretion, BW: Körpergewicht. Weitere Erklärungen siehe Text.

C.3.2.5 Analyse der Kalium-Molmengen

Neben Diurese und Natriurese wurde bei den gewählten Bedingungen zusätzlich die Kaliurese untersucht (vgl. Abb. 22). Hierbei konnte im WT mit Ausnahme der Applikation von 4%-NaCl-Lösung keine Steigerung der Kalium-Exkretion beobachtet werden. Ein vergleichbares Bild zeigte sich auch im KO (N-Zahlen analog oben).

WT sham WT 0,9%NaC

l

WT 4% NaC l WT WL

KO sham KO 0

,9%

NaCl KO 4% NaCl

KO WL 0

1 2 3 4 5

12 7 4 14 12 7 4 14

UK

V [µm o l/ g (B W )/ 6h ]

Abb. 22: Kalium-Molmengen nach Applikation osmolar-unterschiedlicher Lösungen Schlundsondierung mit 3% des BWs von Lösungen unterschiedlicher Osmolarität, als Kontrollen wurden

sham-behandelte Tiere verwendet. Gesammelter Urin wurde nach 6h bezüglich Kalium-Exkretion (UK⁺V) analysiert, N=4-14, wie in Säulen angegeben, BW: Körpergewicht. Weitere Erklärungen siehe Text.

C.3.3 Detaillierte Analyse der Urin-Ausscheidung unter forcierter