In vitro Anzucht von Gerste

Für die Anzucht von Gerstenkeimlingen in einem axenischen System wurden die oberflächensterilisierten Samen auf Agarplatten vorgekeimt. Nach 2 Tagen Vorkeimung erfolgt die Umsetzung der sterilen Keimlinge in die Glaszylinder zum 14-tägigen Wachstum. Alle dafür notwendigen Arbeitsschritte fanden unter einer Sterilbank statt.

2.2.1.1 Vorversuche an 3 Gerstensorten

Das Saatgut der Gerste kann während der Entwicklung, Ernte und Lagerung mit verschiedenen Mikroorganismen infiziert werden. Die Besiedelung der Oberfläche der Samen, aber auch ein Eindringen in und unter die Aleuronschicht ist möglich (Ramakrishna et al., 1991). Die Beseitigung dieser Kontaminationen stellt eine große Herausforderung dar.

In Shen (2013) wurden verschiedene Versuche zur Oberflächensterilisation von Gerstensamen mit anschließender Vorkeimung durchgeführt. Mithilfe des Vergleiches von Überlebens-, Keimungs- und Kontaminationsraten wurde die erfolgreichste Methode bestimmt. Das Protokoll dieser Methode wurde für die Vorversuche übernommen.

35 2.2.1.1.1 Oberflächensterilisation der Samen und Vorkeimungsbedingungen Zur Lockerung der Deckspelze werden jeweils 2 bis 3 Samen in sterilem, demineralisiertem Wasser (SDW) für 5 Minuten (min) aufgeweicht. Danach wird die Deckspelze vorsichtig mit einem Skalpell entfernt, wobei der Embryo nicht verletzt werden darf. Die entspelzten Samen werden in einem 50 ml Falconröhrchen aufbewahrt. Für 20-30 entspelzte Samen wird das Falconröhrchen mit 35-40 ml 35%

H₂O₂ befüllt und für 10 min auf einer Rotationsplattform behutsam geschwenkt.

Nach Abgießen des H₂O₂ werden die Samen 5-mal mit SDW gespült. Anschließend werden je 5-6 Samen auf MS-Agarplatten, mit dem Embryo nach oben gerichtet, gelegt und mit Parafilm verschlossen.

Die Agarplatten werden nun für 2 bis 3 Tage im Dunkeln bei 22°C +/- 2°C zur Vorkeimung gelagert.

Zur Ermittlung der Überlebens-, Keimungs- und Kontaminationsraten wurden 4 Wiederholungen mit jeweils 20 Samen pro Sorte angesetzt und nach 2 bzw. 3 Tagen ausgewertet.

Zur Überprüfung der Keimfähigkeit des Saatgutes der 3 Gerstensorten wurde zusätzlich ein Keimungstest an unbehandelten Samen auf wassergetränktem Filterpapier unter oben beschriebenen Vorkeimungsbedingungen durchgeführt.

2.2.1.1.2 Bestimmung der optimalen PEG-Konzentration

Um die Reaktion der Gerstenwurzeln auf Trockenstress zu untersuchen, wurde PEG als Osmotikum eingesetzt (Biswas et al., 2002; Ueda et al., 2004). PEG wirkt als hochmolekulares Osmotikum, das nahezu nicht in die Zellen der Wurzeln eindringen kann. PEG induziert Trockenstress im Nährmedium, indem es das Wasserpotenzial des Mediums herabsetzt und so ein an Wasser limitiertes Milieu schafft.

Die morphologische Reaktion der Wurzel und das Maß der Eintrübung des Nährmediums wurden visuell an 5 verschiedenen PEG-Konzentrationen (2,5%, 5%, 7,5%, 10% und 20% (w/v)) im MS-Medium überprüft.

Hierzu wurden die sterilen, vorgekeimten Samen (Kapitel 2.2.1.1.1) in Glaszylinder umgesetzt, die unter sterilen Bedingungen mit jeweils 500 ml MS-Medium als

36 Kontrolle, bzw. 500 ml MS-Medium mit unterschiedlicher PEG-Konzentration gefüllt und mit Alufolie verschlossen wurden. Die Lagerung der Glaszylinder erfolgte für 10 Tage in einer kontrollierten Klimakammer mit einem Tag/Nacht Zyklus von 16/8 h, 22 °C Tages- bzw. 20 °C Nachttemperatur und einer durchschnittlichen Lichtintensität von 160 μE m^-2 s^-1.

2.2.1.1.3 Testserie zur Bestimmung der Wurzelarchitektur von 3 Gerstensorten Um das Wurzelwachstum und die Wachstumsbedingungen im axenischen System zu beobachten erfolgte eine erste Testserie an 3 Gerstensorten.

Je ein steriler (Abschnitt 2.2.1.1.1) Keimling wurde in den Mittelpunkt der 2 l Glaszylinder unter sterilen Bedingungen umgesetzt und die Zylinder mit Folie verschlossen. Das Umpflanzen muss sehr behutsam erledigt werden, da die feinen Wurzeln sonst verletzt werden könnten. Nach 2 Tagen Vorkeimung ist dafür der geeignetste Zeitpunkt. Die Koleoptile hat etwa eine Länge von 1 cm erreicht und die primären Wurzeln sind zwischen 0,5 cm und 1,5 cm lang. Falls die Wurzeln länger sind, besteht die Gefahr der Verletzung der Wurzel. Bedingt durch die Oberflächenspannung des Mediums können die Wurzeln dann schneller knicken und verletzt werden.

Pro Sorte wurden 4 Individuen im MS-Kontrollmedium und ein Individuum im PEG-Medium (5% PEG (w/v)) angezogen, die Versuche wurden 5-mal wiederholt.

Die Lagerung der Glaszylinder erfolgte jeweils für 14 Tage in einer kontrollierten Klimakammer mit einem Tag/Nacht Zyklus von 16/8 h, 22 °C Tages- bzw. 20 °C Nachttemperatur und einer durchschnittlichen Lichtintensität von 160 μE m^-2 s^-1. Anschließend wurden die Wurzeln visuell überprüft und auf der Bildaufnahme-Plattform fotografiert.

37 2.2.1.2 In vitro Anzucht von 6 Gerstensorten unter revidierten Bedingungen Die aus den Vorversuchen (Abschnitt 2.2.1.1) gewonnen Erkenntnisse wurden eingesetzt, um die Bedingungen für das Wachstum der Gerste im axenischen System zu verbessern.

2.2.1.2.1 Oberflächensterilisation und Vorkeimungsbedingungen

Das Protokoll zur Oberflächensterilisation (Ramakrishna et al., 1991; Götz et al., 2007; Kutter et al., 2006; Harwood et al., 2009; Li et al., 2011) der Gerstensamen wurde leicht verändert übernommen.

Die Samen (60-70 Stück) werden in einem 50 ml Falconröhrchen mit 40 ml 1 % (v/v) Tween20 Lösung für 2 min sanft geschüttelt und anschließend 2-mal mit SDW gespült. Danach folgt eine 5-minütige Einwirkzeit in 40 ml 70% Ethanol auf einer Rotationsplattform. Die Rotationsgeschwindigkeit wird so gewählt, dass sich die Samen bewegen, aber nicht ständig an die Wand des Falconröhrchen stoßen, um Verletzungen zu vermeiden. Nach 3-maligem Spülen mit SDW wird das Röhrchen mit 40 ml NaOCl (10-12% aktives Chlor) aufgefüllt und für 10-13 min auf der Rotationsplattform bewegt. Die Dauer der Einwirkzeit ist abhängig vom Grad der Kontamination des Saatgutes. Anschließend werden die Samen 5-mal mit SDW gespült und verbleiben für 3 h in 40 ml SDW zum Einweichen auf der Rotationsplattform. Dies dient der Lockerung der Spelze und der Verbesserung der Zugänglichkeit der Kornoberfläche, um darunter liegende Infektionen im nächsten Sterilisationsschritt erreichen zu können. Abschließend werden die Samen noch einmal in 40 ml NaOCl für 10 min bewegt und danach 3-mal mit SDW gespült und zum Antrocknen in ein neues Falconröhrchen überführt.

Je 5-6 Samen werden auf Nährmedium-Platten (Abschnitt 2.1.2.1), mit dem Embryo nach oben gerichtet, gelegt und mit Parafilm verschlossen. Die Petrischalen werden in Alufolie gehüllt und für 2 bis 3 Tage im Dunkeln bei 22°C +/- 2°C zur Vorkeimung gelagert. Alle Arbeitsschritte fanden unter einer Sterilbank statt.

Das verwendete Nährmedium wird primär für bakteriologische Analysen von Wasser und Lebensmitteln eingesetzt, bei denen Hygiene eine große Rolle spielt. Es unterstützt das Wachstum einer großen Palette an Mikroorganismen mit geringem

38 Nährstoffanspruch. Das Nährmedium wurde aufgrund dieser Eigenschaften für die Keimungsversuche ausgewählt. Kontamination an den Samen können relativ schnell, d.h. meist nach 2 Tagen, entdeckt werden. Dies trägt sehr zur Minimierung der Übertragungsrate von infizierten Keimlingen in das axenische System bei.

Zur Ermittlung der Überlebens-, Keimungs- und Kontaminationsraten des Sterilisations- und Keimungsprozesses wurden 4 Wiederholungen mit jeweils 20 Samen an den Sorten Barke, Grace und Braemar angesetzt und nach 2 bzw. 3 Tagen ausgewertet.

2.2.1.2.2 Unterschiedliche Umweltbedingungen im axenischen System

Für die Versuche wurden die 6 Gerstensorten 4 verschiedenen Behandlungen (Kontrolle, PEG, Phosphatmangel und Nitratmangel) ausgesetzt. Die Herstellung der Nährmedien für die in vitro Anzucht erfolgte wie in Abschnitt 2.1.2.4 beschrieben.

Die Glaszylinder waren mit 500 ml Nährmedium jeweils für Kontrolle, PEG und Phosphatmangel und mit 750 ml für Nitratmangel befüllt.

Um bei der Pflanze Nährstoffmangel zu induzieren, wurde die Phosphatkonzentration von 1,25 mM (Kontrolle) auf 0,2 mM (Phosphatmangel) und die Stickstoffkonzentration (NH4NO3) von 60 mM (Kontrolle) auf 0,2 mM (Nitratmangel) herabgesetzt (Ingram et al., 2012). Die Bestimmung der PEG-Konzentration basiert auf den Ergebnissen der Vorversuche (Abschnitt 2.2.1.1.2).

Die vorbehandelten Keimlinge (Abschnitt 2.2.1.2.1) wurden nun, wie im Abschnitt 2.2.1.1.3 beschrieben, in das axenische System überführt und für 14 Tage in einer kontrollierten Klimakammer mit einem Tag/Nacht-Zyklus von 16/8 h, 22 °C Tages- bzw. 20 °C Nachttemperatur und einer durchschnittlichen Lichtintensität von 160 μE m^-2 s^-1 gelagert. Bei der Auswahl der Keimlinge wurden nur diejenigen ohne erkennbare mikrobielle Infektion auf den Nährmedium-Platten berücksichtigt. Aus diesen wurden dann die Keimlinge verwendet, die sich in einem ähnlichen Entwicklungsstadium befanden.

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