Verwendung zweier Primärantikörper gleicher Herkunftsspezies

Sollen auf einem Schnitt zwei Strukturen spezifisch immunmarkiert werden und stehen für die entsprechenden Antigene nur Antikörper gleicher Herkunftsspezies und gleicher Immunglobulin-Subtypen zur Verfügung, so ergibt sich zwangsläufig das Problem, daß die eingesetzten Sekundärantikörper ohne weitere Maßnahmen beide Primärantikörper detektieren.

Im Rahmen dieser Arbeit sind mehrere Doppelmarkierungen mit zwei Primärantikörpern aus der Maus durchgeführt worden. Hierbei kamen verschiedene Prozeduren zur Anwendung, die nachfolgend beschrieben sind.

2.2.3.2.1 „Biotinylierung“ des zweiten Primärantikörpers

Bei diesem Ansatz wird auf die Verwendung eines zweiten Sekundärantikörpers, der zwangsläufig beide Primärantikörper detektieren würde, verzichtet. Stattdessen wird der zweite Primär-AK seinerseits bereits vor Aufbringen auf die Schnitte mit biotinylierten Anti-Maus-F(ab)-Fragmenten markiert, quasi „indirekt biotinyliert“, was den Einsatz von Avidin-konjugierten Enzymen und Fluoreszenzfarbstoffen zu seiner Detektion ermöglicht.

Nachteilig an diesem Verfahren ist jedoch die fehlende Amplifizierung des Signals des

„indirekt biotinylierten“ Primär-AKs durch einen Sekundär-AK. Es ist somit notwendig, den „stärkeren“ der beiden Primär-AK für die „indirekte Biotinylierung“ zu verwenden.

Angewendet wurde folgendes Procedere:

1) Aufbringen des ersten, „schwächeren“ Primär-AKs auf die Schnitte

2) Aufbringen eines AP- bzw. Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Ziege-anti-Maus-Ig 3) Gründliches Spülen mit PBS

5) Abblocken der nicht gebundenen biotinylierten Anti-Maus-F(ab)-Fragmente mit Normal-Maus-Serum (15 min, Raumtemperatur)

6) Aufbringen des so „indirekt biotinylierten“ zweiten Primär-AKs auf die Schnitte 7) Aufbringen mit Peroxidase bzw. Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Avidins auf die

Schnitte.

Sowohl die biotinylierten Anti-Maus-F(ab)-Fragmente („Biotinylation Reagent“) als auch das hier verwendete Normal-Maus-Serum („Blocking Reagent“) sind Bestandteil des DAKO Animal Research Kit „ARK™“. Die Menge der einzusetzenden F(ab)-Fragmente ist abhängig von der Konzentration der Immunglobuline und der Menge des zu modifizierenden Primär-AKs und richtete sich nach der dem Produkt beiliegenden Gebrauchsvorschrift.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Protokolls aus Abschnitt 2.2.3.2.1

1 2

Ziege-anti-Maus, gekoppelt an Enzym / Fluo-Farbstoff A

Avidin – Enzym / Fluo-Farbstoff B - Komplex

Antigen X Maus-anti-X

Antigen Y

3 4 Maus-anti-Y, mit

biotinylierten F(ab)-Fragmenten gekoppelt

2.2.3.2.2 Blockierung mit unkonjugierten Anti-Maus-F(ab)-Fragmenten

Bei diesem Ansatz handelt es sich um ein Protokoll, das von LEWIS CARL et al. 1993 veröffentlicht und für diese Untersuchung modifiziert wurde (vgl. ferner NEGOESCU et al., 1994). Nach Aufbringen von erstem Primär- und Sekundär-AK auf die Schnitte werden zunächst alle noch freien Bindungsstellen des Sekundär-AKs mit unspezifischen Maus-Immunglobulinen (Normal-Maus-Serum, DAKO) abgesättigt. Somit wird eine Interaktion von erstem Sekundär-AK und zweitem Primär-AK verhindert. Nachfolgend werden sämtliche Bindungsmöglichkeiten sowohl am ersten Primär-AK als auch an den unspezifischen Maus-Immunglobulinen mit monovalenten, polyklonalen, unkonjugierten Anti-Maus-F(ab)-Fragmenten abgesättigt, was eine Interaktion von erstem Primär-AK und zweitem Sekundär-AK verhindert.

Der Vorteil dieses Protokolls liegt in der nahezu freien Adaptierbarkeit an alle Kombinationen primärer und sekundärer Antikörper.

Angewendet wurde folgendes Procedere:

1) Aufbringen des ersten, „schwächeren“ Primär-AKs auf die Schnitte 2) Aufbringen des ersten Sekundär-AKs auf die Schnitte

3) Absättigung noch freier Bindungsstellen am Sekundär-AK durch unspezifische Maus-Immunglobuline (Normal-Maus-Serum)

4) Absättigung aller Bindungsmöglichkeiten am Primär-AK und an den unspezifischen Maus-Immunglobulinen durch monovalente, polyklonale, unkonjugierte Ziege-anti-Maus-F(ab)-Fragmente

5) Gründliches Spülen mit PBS

6) Aufbringen des zweiten, „stärkeren“ Primär-AKs auf die Schnitte 7) Aufbringen des zweiten Sekundär-AKs auf die Schnitte.

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Protokolls aus Abschnitt 2.2.3.2.2

Ziege-anti-M F(ab)

aus-unspezifisches

Maus-Immun-globulin

Ziege-anti-Maus, gekoppelt an Enzym / Fluo-Farbstoff B Maus-anti-Y

Ziege-anti-Maus, gekoppelt an Enzym / Fluo-Farbstoff A 2

5 6 3 4 1

Antigen Y Maus-anti-X

Antigen X

2.2.3.2.3 Tyramid-Signal-Amplifikation (TSA)

Bei diesem Verfahren, gelegentlich auch als CARD (catalyzed reporter deposition) bezeichnet, nutzt man die Tatsache, daß Tyramid von Peroxidase zu hochreaktiven Tyramid-Radikalen umgesetzt wird, welche kovalent an Tyrosin-Seitenketten von Proteinen in unmittelbarer Umgebung binden. So kann beispielsweise ein Antigen mit einem unkonjugierten Primär-AK detektiert werden, welcher anschließend mit einem Peroxidase-konjugierten Sekundär-AK detektiert wird, oder zur weiteren Verstärkung mit einem biotinylierten Sekundär-AK und nachfolgender Inkubation mit Streptavidin-Peroxidase. Die Peroxidase setzt schließlich beispielsweise ein Tyramid-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugat um, welches sich in unmittelbarer Umgebung absetzt, wobei es allerdings zu einer geringen diffusionsbedingten Verminderung der Auflösung kommt.

Die im Vergleich zu anderen immunhistochemischen Verfahren dramatisch höhere Verstärkung ermöglicht die Verwendung eines Primär-AKs in extremer Verdünnung. Wird das TSA-Verfahren bei Doppelmarkierungen unter Verwendung zweier Primär-AK aus der gleichen Herkunftsspezies als erstes System verwendet, kann der Primär-AK derart stark verdünnt werden, daß er für den zur Detektion des zweiten Primär-AKs verwendeten herkömmlichen Sekundär-AK so gut wie nicht zu detektieren ist, wobei mit TSA aber ein gutes Signal erzielt werden kann. Für eine genauere Beschreibung des Verfahrens vgl.

beispielsweise SHINDLER und ROTH (1996), WANG et al. (1999), UCHIHARA et al. (2000) oder BROUNS et al. (2002).

Zur Anwendung kam folgendes Protokoll (zwei Primärantikörper aus der Maus):

1) Aufbringen des ersten Primär-AKs in einer deutlich stärkeren Verdünnung als üblicherweise bei Zwei-Schritt-Protokollen angewandt

2) Inkubation mit einem Peroxidase-konjugierten Sekundär-AK 3) Inkubation mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertem Tyramid 4) Gründliches Spülen mit PBS

5) Aufbringen des zweiten Primär-AKs in herkömmlicher Verdünnung 6) Aufbringen des zweiten Sekundär-AKs.

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Protokolls aus Abschnitt 2.2.3.2.3

Tyrosin-Seitenkette von Proteinen

Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Tyramid-Derivat

Fluoreszenz-farbstoff Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes aktiviertes Tyramid-Derivat

Fluoreszenz-farbstoff

HRP

Fluoreszenz-farbstoff

Fluoreszenz-farbstoff

Fluoreszenz-farbstoff

Peroxidase HRP

Fluoreszenz-farbstoff

Fluoreszenz-farbstoff

Fluoreszenz-farbstoff H2O2

Fluoreszenz-farbstoff

Antigen

2.2.3.2.4 Kombination von TSA und Blockierung mit F(ab)-Fragmenten

Soll eine Kolokalisation zweier Antigene mit zwei Primärantikörpern aus gleicher Herkunftsspezies nachgewiesen werden, so muß eine Kreuzreaktivität von erstem Primär- mit zweitem Sekundärantikörper und / oder von erstem Sekundär- mit zweitem Primärantikörper bestmöglich ausgeschlossen werden.

Hierzu bietet es sich an, die Protokolle aus den Abschnitten 2.2.3.2.2 und 2.2.3.2.3 zu kombinieren. Dabei wird der erste Primär-AK stark verdünnt und mittels Tyramid-Signal-Amplifikation visualisiert. Zusätzlich wird unmittelbar nach der Inkubation mit Tyramid eine Blockierung mit Normal-Maus-Serum und anschließend unkonjugierten Anti-Maus-F(ab)-Fragmenten vorgenommen, bevor schließlich das zweite Antikörper-System aufgebracht wird.