Verwendete Zelltypen

2.1.1 Kultur von CSM 14.1 Neuronen

In der vorliegenden Arbeit wurden überwiegend CSM14.1 Neurone verwendet (siehe Abbildung 10). CSM14.1 Neurone sind immortalisierte, nigrostriatale Rattenzellen (Haas und Wree 2002). Die Neurone können als dopaminerge Zelllinie charakterisiert werden, da sie die dopaminergen Marker Nurr1, Tyrosin Hydroxylase und ALDH2 exprimieren. Bei 32°C, 5 % CO2 und Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre wurden die Neurone in Kulturmedium (DMEM Vollmedium, PAA, Cölbe) befüllten 10 cm ∅ Zellkulturschalen (Greiner bio-one, Solingen) kultiviert (Inkubator: Function line, Heraeus, Hannover). Die Zellen besitzen ein Temperatur-sensitives Antigen über das sie differenziert werden können.

Die Differenzierung erfolgte durch Kultivierung der Neurone für 14 Tage bei erhöhter Inkubationstemperatur von 39°C anstatt 32°C unter ansonst gleichen Bedingungen. Während der Differenzierung entwickeln die Zellen einen neuronalen Phänotyp sowie ein vergrößertes Zytoplasma, was die Beobachtung der Mitochondrienmorphologie vereinfachtete. In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich differenzierte CSM14.1 Neurone (dCSM14.1) genutzt.

Sobald die CSM14.1 bzw. dCSM14.1 Neurone nahezu konfluent (ca. 90 % Flächen-belegung) gewachsen waren, wurden sie auf eine neue Kulturschale passagiert (in der Regel alle 3-4 Tage). Zum Passagieren unter sterilen Bedingungen (biologische Sicherheitssteril-werkbank, Heraguard, Heraeus, Hannover) wurde das Kulturmedium abgesaugt und die Neurone einmal mit PBS gewaschen. Zum Lösen des Zellrasens wurden 3 ml 1%-ige Trypsinlösung (PAA, Cölbe) auf die Platten gegeben. Sobald sich der Zellrasen gelöst hatte wurde die Zellsuspension in ein Reaktionsgefäß überführt und 6 ml Kulturmedium zu den Neuronen gegeben. Das in dem Kulturmedium enthaltene fötale Kälberserum (PAA, Cölbe) inaktiviert das Trypsin. Die Neurone wurden 5 min mit 1500 rpm bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden sie in 1 ml Kulturmedium re-suspendiert und ca. 150 µl der Neuronenlösung auf neue Kulturschalen ausplattiert, welche bis zur erneuten Passagierung kultiviert wurden.

Zur Bestimmung einer definierten Zellzahl wurde nach dem Resuspendieren des Pellets eine Probe der Neuronensuspension von 10 µl entnommen, mit 90 µl Trypanblau (Sigma, Steinheim) versetzt und die Zellen lichtmikroskopisch in einer Neubauer-Zählkammer (Hecht-Assistent, Sondheim) ausgezählt, so dass der Neuronengehalt der Suspension bestimmt wurde und anschließend ein definiertes Suspensionsvolumen ausplattiert werden konnte.

Um einen Vorrat an dCSM14.1 Neuronen zu erhalten wurden die Zellen anstatt in einem Milliliter Kulturmedium in 750 µl Einfrierlösung resuspendiert und in Kryoröhrchen (Nunc, Wiesbaden) zunächst bei -20°C eingefroren. Nach 1-2 h wurden die Kryoröhrchen in flüs-sigen Stickstoff überführt, wo sie bis zum Gebrauch verblieben.

Die eingefrorenen Neurone wurden nach schnellem Auftauen bei 37°C in eine 10 cm ∅ Kulturschale befüllt mit Kulturmedium überführt und unter den üblichen Bedingungen er-neut kultiviert.

Abbildung 10: dCSM14.1 Neurone.

Abgebildet ist ein Phasenkontrastbild (10-fach vergrößert) einer differenzierten dCSM14.1 Kultur. Die Zellen weisen ein großes Zytoplasma auf sowie kurze Fortsätze.

2.1.2 Kultur von primären Mittelhirnneuronen

Adulte weibliche Ratten (Hannover-Wistar, Charles River/Sulzfeld) wurden am 14. Tag nach Verpaarung durch CO₂-Begasung getötet. Der Bauch wurde mit Ethanol (70 %) ge-reinigt und das Peritoneum geöffnet. Die Uteri wurden entnommen, in CMF-Medium über-führt und geöffnet. Die gewonnenen Embryonen wurden sofort in neues eiskaltes CMF-Medium transferiert. Die folgenden Schritte fanden in eiskaltem CMF - Medium unter visueller Kontrolle mit einem binokularen Mikroskop statt (Stemi 2000, Zeiss, Göttingen).

Zuerst wurde der Kopf der Embryonen abgetrennt und das Gehirn entnommen. Der Hirnstamm wurde isoliert, die Hirnhäute entfernt und die Verbindung zwischen Diencephalon und Mesencephalon durchtrennt. Als Referenz diente hierbei die Colliculi des

Diencephalons. Der Hirnstamm wurde mit der dorsalen Seite nach unten ausgerichtet. Das Tektum wurde ausgebreitet und der rostrale Teil des ventralen Hirnstammes sowie der rostrale Teil des Tektums entfernt. Der mediale Teil des verbleibenden rostralen Hirnstammes (ca. 1,0 mm³) wurde herausgeschnitten und in ein mit eiskaltem CMF-Medium befüllten Reaktionsgefäß überführt.

Alle so präparierten Gewebestücke wurden gesammelt und anschließend zentrifugiert (700 rpm, 4 min, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet 15 min mit 750 µl Trypsin (0,25 %) im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Trypsin mit 750 µl eiskaltem fötalen Kälberserum (FCS) inaktiviert und die Suspension 3 min lang bei Raum-temperatur mit 40 µl DNAse (10 mg/ml; Sigma, Steinheim) versetzt. Bei der vorsichtigen Trituierung mittels einer flammengerundeten silanisierten Pasteur-Pipette wurden die Gewe-bestücke mechanisch dissoziiert. Nach Absetzen der verbliebenen GeweGewe-bestücke wurde der Überstand in ein neues Gefäß überführt und das nicht dissoziierte Gewebe zum zweiten mal einer Trypsinierung und Trituierung unterzogen. Die so gewonnene Zellsuspension wurde erneut bei 700 rpm 4 min lang bei 4°C zentrifugiert und das Pellet in 1 ml Mittelhirn-Kul-turmedium (4°C) resuspendiert (für Weiterbehandlung der Neurone siehe Kapitel 2.2.2.2.1) und ausplattiert (siehe Abbildung 11). Auszählungen ergaben, das die Kultur vorwiegend GABAerge und bis zu 20 % TH-positive Neurone enthielt. Diese stellen sämtliche Neurone des dopaminergen Phänotyps dar, da durch die Topographie des Präparationsgebietes die ebenfalls TH-positiven noradrendergen und adrenergen Neurone ausgeschlossen wurden (Shimoda et al. 1992).

Abbildung 11: Primäre Mittelhirnkultur.

Dargestellt ist ein Phasenkontrastbild (20-fach vergrößert) einer primären Mittelhirnkultur. Die Neurone bilden lange Fortsätze aus und nehmen somit Kontakt zu anderen Neuronen auf.

Zur besseren Haftung der Primärneurone erfolgt die Kultivierung auf Poly-L-Ornithin/Laminin (Sigma, Steinheim) beschichteten Zellkulturplatten. Zur

Beschichtung wurden die Platten für mindestens 4 h mit Poly-L-Ornithin (0,1 mg/ml) bei Raumtemperatur benetzt. Nach zweimaligem waschen mit destilliertem Wasser wurden die Platten mit Laminin (1 µg/ml) überschichtet und über Nacht bei 37°C inkubiert. Vor der Zellaussaat wurden die Platten nochmals mit DMEM-F12 (PAA, Cölbe) gewaschen. Eine gute Haftung der Primärneurone wurde erzielt, wenn die Platten nicht länger als 48 h vor Zellaussaat beschichtet wurden.

Die primären Mittelhirnkulturen wurden bei 37°C, 5 % CO2 und Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre kultiviert (Inkubator: Function line, Heraeus, Hannover). Die Lebensdauer der Kultur betrug ca. 10 Tage. Medienwechsel erfolgten jeweils am 1. Tag nach der Präparation und darauffolgend an jedem zweiten Tag.

2.2 Molekularbiologische Methoden