Die Deletionsmutante ΔAspf3 zeigte im Tierversuch eine stark verminderte Virulenz, und durch die Verwendung von Aspf3 als Impfstoff konnte sowohl in eigenen Versuchen als auch in Versuchen einer anderen Arbeitsgruppe [63] eine protektive Immunreaktion ausgelöst werden.
Alveolarmakrophagen sind die primären phagozytierenden Zellen innerhalb der Atemwege und somit eine wichtige Abwehrkomponente. An der Abtötung geschwollener Konidien durch Makrophagen sind unter anderem reaktive Sauerstoff-Metabolite (ROI) beteiligt [41]. Konidien, die den Alveolarmakrophagen entgangen sind, wachsen aus und werden durch Neutrophile angegriffen. Neutrophile heften sich an die Oberfläche der Hyphen. Dieser Kontakt zwischen Neutrophilen und Hyphen löst unter anderem die respiratorische Entladung und die Sekretion der ROI aus (zur Übersicht [89]). Mehrere Gene, die an der Abwehr gegen die ROI bei A.fumigatus beteiligt sind, konnten charakterisiert werden. Obwohl eine Deletion dieser Gene die Empfindlichkeit der jeweiligen Mutante gegenüber der ROI erhöht, konnte durch keine dieser Mutanten eine reduzierte Virulenz im Mausmodell herbeigeführt werden. Große Wichtigkeit wurde auch dem Schlüsseltranskriptionsregulator AfYap1 zugesprochen, der an der Regulation mehrerer Abwehrgene gegen ROI beteiligt ist [89]. Auch Aspf3 scheint zum Teil der AfYap1-Kontrolle zu unterliegen. Für dieses Molekül stand bislang jedoch eine genauere Untersuchung bezüglich seines Einflusses auf die Virulenz von Aspergillus aus.
Das Allergen Aspf3 wird von dem Pilz produziert [90], und es wird vermutet, dass es sich um ein peroxisomales Membranprotein handelt [91]. Es wurde jedoch auch in größerer Menge auf der Konidienoberfläche gefunden [15] und ruft sowohl bei einer experimentellen Infektion im Tier als auch nach einer invasiven Aspergillose im Menschen eine regelhafte Antikörperreaktion hervor [66]. Deshalb kann auch mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer Produktion im Hyphenstadium ausgegangen werden.
Wachstum unter oxidativem Stress
Ausgehend von der hypothetischen Funktion von Aspf3 wurde von uns vermutet, dass es am Schutz der Pilze gegen oxidativen Stress durch Inaktivierung entsprechender Radikale beteiligt ist. Die Deletionsmutante ΔAspf3 wies im Phänotyp eine starke Empfindlichkeit gegenüber Wasserstoffperoxid (Abb. 20) im Vergleich zu der
Komplementmutante ∆Aspf3K oder dem Wildtyp D141 auf. Dies legt ebenfalls nahe, dass Aspf3 für eine Peroxireduktase kodiert. Da an der Abwehr von Sauerstoffradikalen eine Reihe weiterer Effektoren beteiligt sind [89], war eine so deutlich gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber Wasserstoffperoxid (Abb. 20) nicht zwangsläufig zu erwarten. Dabei war zwar der Phänotyp der von uns generierten Komplementmutante
∆Aspf3K mit vollständig wieder hergestellter Resistenz des Hyphenwachstums unter Bedingungen des oxidativen Stresses ausgestattet. Jedoch fand sich bei den Wasserstoffperoxidkonzentrationen, bei denen die Deletionsmutante überhaupt kein Wachstum mehr zeigte, eine noch leicht eingeschränkte Sporulation (Abb. 21). Dieses könnte am ehesten darauf hinweisen, dass die erreichte Komplementierung funktionell nicht ganz vollständig gewesen ist, was auch die inkomplette Restauration der Virulenz im Tierversuch erklären könnte (s. unten).
Virulenzversuche
Mit den Aspf3-Mutanten wurde ein Virulenzversuch durchgeführt. Mäuse wurden mit der Deletionsmutante ∆Aspf3, der Komplementmutante ∆Aspf3K oder dem Wildtyp D141 infiziert (Abb. 36). Der Virulenzunterschied zwischen der Deletionsmutante
∆Aspf3 und dem Wildtyp D141 ist höchst signifikant (***P=0,0001), was einer drastischen Verminderung der Virulenz entspricht. Die Komplementmutante ∆Aspf3K zeigte allerdings nur eine teilweise wiederhergestellte Virulenz und somit keine vollständige Restauration.
Der aufgetretene Virulenzunterschied zwischen der Deletionsmutante ∆Aspf3 und der Komplementmutante ∆Aspf3K war eigentlich nicht zwangsläufig zu erwarten, denn eine Deletion des übergeordneten Schlüsseltranskriptionsregulators AfYap1 erbrachte keine Virulenzminderung im Mausmodell [89]. Es ist somit anzunehmen, dass sich Aspf3 in entscheidenden Situationen des Infektionsprozesses der übergeordneten Regulierung durch AfYap1 entzieht und autonom anders reguliert wird.
Aspf3 als Impfstoff
Ito et al. [63] konnten durch Verimpfung von rekombinantem Aspf3 im Tierversuch eine protektive Immunreaktion auslösen. Der von uns durchgeführte Vakzinierungsversuch mit rekombinantem Aspf3 (Abb. 28, Impfgruppe 2) erbrachte ebenfalls einen signifikant protektiven Effekt durch den Impfstoff (*P=0,0412). Eine
NCBI-BLAST-Suche (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) von Aspf3 erbrachte etliche Übereinstimmungen mit anderen Aspergillus-Arten. Die am stärksten homologen Proteine gehören zu den folgenden Spezies: A.fischerianus (99 %), A.clavatus (93 %) und A.terreus (92 %). Es ist daher möglich, dass ein Aspf3-basierter Impfstoff auch Schutz gegenüber verschiedenen Pilzpathogenen vermitteln könnte [63].
Da für die Komplementmutante ∆Aspf3K nur ein teilweise wieder hergestellter Phänotyp aufgezeigt werden konnte, wurde das entsprechende Komplementierungsplasmid (Abb. 16, pAspf3-del-komplementiert) im Bereich des Gens Aspf3 sequenziert. Durch einen Vergleich mit der Originalsequenz (Aspergillus Genome Database; http://www.aspgd.org/) wurde der Austausch von fünf Basen festgestellt. Es handelt sich hierbei eventuell um nicht kodierungsrelevante Unterschiede des von uns verwendeten Wildstamms D141 im Vergleich zum Sequenzierstamm. Allerdings ist es ebenfalls möglich, dass die Basenaustausche PCR-bedingte Amplifikatfehler darstellen. Diese könnten z.B. zu einem insuffizienten Spleißen beitragen [92] und damit zu einer möglichen funktionellen Beeinträchtigung führen, die den unvollständig restaurierten Phänotyp erklären könnte.
Die stark verminderte Virulenz der Deletionsmutante ∆Aspf3, bei zumindest teilrestaurierter Virulenz durch die Komplementmutante ∆Aspf3K, lässt vermuten, dass Aspf3 eine entscheidende Rolle während der Pathogenese spielt. Ohne den künstlichen Zusatz von Sauerstoffradikalen in vitro lässt sich zudem kein veränderter Phänotyp erkennen, so dass man es wagen kann, der Peroxireduktase eine spezifische Rolle während des Infektionsprozesses zuzuweisen und sie deshalb auch als „Virulenzfaktor“
zu bezeichnen. Eine spezifische Inhibition im Sinne einer pharmakologischen
„Targetierung“ könnte deshalb alternative Therapieoptionen bieten. Sofern sich eine Therapiemöglichkeit bestätigt, dürfte die relativ geringe Homologie zu menschlichen Proteinen (ähnelt mit 31 % am stärksten dem humanen Peroxiredoxin des Typs V) eine gute Chance dafür bieten, dass ein entsprechendes Therapeutikum wenige Kreuzreaktionen mit menschlichen Proteinen hat, was sich in einem günstigen Nebenwirkungsspektrum niederschlagen dürfte.