Versuche am Kleingefäßmyographen

Für Versuche am Small Vessel Myographen sind die Entnahme und Präparation von Tiergefäßen von großer Bedeutung. Dabei ist von besonderer Relevanz, dass dieser

Vorgang mit höchster Sorgfalt abläuft. Ein atraumatisch entnommenes und vorsichtig präpariertes Gefäß ist die Grundlage eines erfolgreichen Versuches.

Die Methodik des Kleingefäßmyographen erlaubt lediglich Aussagen zu Gefäßen mit einem Innendurchmesser von 100 m bis 2 mm. Diese so genannten proximalen Widerstandsgefäße sind in ihrer Rolle als Regulatoren des peripheren Widerstandes und der Anpassung des Blutflusses auf den Bedarf der jeweiligen Organe von zentraler Bedeutung in der Erforschung des Bluthochdrucks.

Versuchstiere

Alle Tiere wurden in den Tierställen der Charité-Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, unter Standardlaborbedingungen gehalten. Für die Versuche erteilte das Landesamt für Landesschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit die Genehmigung (O0212-02).

Für die Untersuchungen wurden Mäuse der Stamms C57Bl6 verwendet. Da sich Unterschiede in der Gefäßfunktion auch aus der Tierart ergeben, wurden nur Mäuse als Versuchstiere eingesetzt.

Die Tierhaltung erfolgte in Käfigen aus Makrolon mit einem Standarddeckel von EBECO^®, eingestreut mit Weichholzspänen. Die Tiere wurden unter Standardlaborbedingungen gehalten, dies bedeutet bei 22 ± 1°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 ± 5 %, sowie einem künstlichen Tag-Nacht-Rhythmus von 12 Stunden. Sie erhielten Pressfutter und Wasser ad libitum.

Die Versuchsmäuse waren zum Zeitpunkt der Tötung etwa 3 Monate alt und wogen (20 ± 2) g. Die Tötung wurde durch intraperitoneale Applikation von Urethan mit anschließender Organentnahme vorgenommen.

Die Gefäßentnahme und -präparation

Nach Anästhesierung bis zur Schmerzfreiheit durch Urethan (Carbamate, 1,4 g pro kg Körpergewicht), erfolgte eine mediane Thorakotomie mit Durchtrennung des Zwerchfells und anschließender Freilegung der thorakalen Aorta. Das Gefäß wurde auf gewünschter Höhe durchtrennt und unter Zuhilfenahme einer Mikroschere entnommen. Dabei galt zu verhindern, dass es zu einer Dehnung des Gefäßes kommt, da hiernach strukturelle Schäden und somit Endotheldysfunktionen auftreten.

Im unmittelbaren Anschluss an die Mobilisation des Gefäßes erfolgte die Lagerung in gekühlter, Carbogen-begaster Tyrodelösung.

Unter einem Dissektionsmikroskop konnte nun die Adventitia bei 10facher Vergrößerung abpräpariert und das Gefäß in ca. 2 mm lange Ringe geschnitten werden. Die Aorta befand sich hierfür in einer mit einem Polymer (Sylgaard) beschichteten Petri-Schale, sodass sie lediglich adhäsiv, nicht aber mechanisch fixiert wurde.

Es folgte das Einspannen in den Myographen. Zunächst wurde durch das Lumen jedes Ringsegments ein 2 cm langer Draht mit einer Stärke von 40 m gezogen.

Dann wurde der Gefäßring in die Kammer des Myographen transferiert.

Einspannen und Äquilibrieren

Das mit einem Draht durchzogene Gefäßsegment wurde zwischen die Trägerbacken in 37 °C warme und Carbogen-begaste Tyrode-Lösung gelegt. Dann erfolgte das Befestigen des Drahtes unter den Schrauben einer Trägerbacke. Anschließend wurde ein weiterer Draht durch das Lumen gezogen. Analog kam es zur Fixierung an der gegenüberliegenden Trägerbacke.

Abbildung 12: Schematische Zeichnung der Kammer des Myographen mit Trägerbacken, Gefäßring und Drähten

Besonders galt es zu beachten, dass das eingespannte Gefäß nicht zwischen Draht und Träger eingeklemmt wurde, sondern weiterhin frei beweglich auf den beiden Drähten auflag.

Nun konnte die Kammer mit ihrer Abdeckung versehen, und sogleich die Absaugvorrichtung in die Kammer eingebracht werden. Zudem erfolgte der Anschluss an die Messeinheit. Um die Leitfähigkeit zu erhöhen, wurde die Verbindung zwischen Messeinheit und Kammer mit Vaseline eingeschmiert.

Durch Drehen der Mikrometerschraube konnten dann die Trägerbacken auseinander gezogen werden, bis sie sich nicht mehr berührten, während das Gefäß auch weiterhin spannungsfrei auflag. Diese Einstellung wurde als spannungsfreier Grundtonus des Gefäßes festgelegt und mit einer Spannung von 0 mN am Myo-Interface beziffert.

Daraufhin wurden die Trägerbacken erneut auseinander geschoben, bis eine Vorspannung von 12 mN erreicht wurde. Es folgte eine Äquilibrierung der Gefäße über 60 Minuten zur Normalisierung des Gefäßinnendrucks bei einer konstanten Vorspannung von 12 mN.

Vorkaskade

Im Anschluss an die Phase der Äquilibrierung wurde die Unversehrtheit des Aortensegments überprüft. Hierfür wurde zunächst die rezeptorunabhängige, durch Änderung des Membranpotentials ausgelöste Kontraktionsfähigkeit des eingespannten Gefäßes überprüft. Dies geschah durch Applikation von 6 ml 1,3 x 10^-3 mol/l KCl. Die Zugkraft der Gefäßringe konnte anhand der Aufzeichnungen in der Myodaq 2.0 Software verfolgt werden. Nach Erreichen eines oberen Plateaus von mindestens 5 mN über dem Ausgangswert von 12 mN wurde mit Tyrode-Lösung ausgewaschen, was zu einem Einbrechen der Kontraktion führte. Nach einigen Minuten Latenzzeit erreichten die Gefäße wieder eine Baseline. Allerdings ist anzumerken, dass die zu Beginn des Versuches eingestellte Vorspannung sich nach den ersten Kontraktionen und dem darauf folgenden Auswaschen auf einem niedrigeren Niveau stabilisierte, sodass weiteres Vorspannen von Nöten war. Der beschriebene Vorgang wurde mehrmals wiederholt, bis eine konstante Baseline erreicht wurde.

Sollte ein Gefäß auf die Applikation von KCl in entsprechender Konzentration mit einer Kontraktion von weniger als 5 mN reagiert haben, so wurde dieses Gefäß vermutlich durch Entnahme und Präparation strukturell geschädigt und musste gegen ein neues Gefäßsegment ausgetauscht werden.

Um die Funktion des Endothels zu prüfen wurde die rezeptorabhängige Wirkung des Sympathomimetikums Phenylephrin (PE) überprüft. Nach Applikation von PE in einer Konzentration von 1,0 x 10^-5 mol/l (d.h. 60 l PE mit einer Konzentration von 1,0 x 10^-3 mol/l in einem Kammervolumen von 6 ml verdünnt) kam es zu einer

starken Kontraktion der Gefäße, sofern ihr Endothel intakt war. Diese Vasokonstriktion erreichte nach einigen Minuten ein oberes Plateau. Nun wurde auch die Dilatation als rezeptorabhängige Funktion geprüft. Hierfür wurden 60 l ACh in Konzentrationen von 1,0 x 10^-7 bis 1,0 x 10^-3 mol/l in die Kammer gegeben (dies entspricht einer Kammerkonzentration von 1,0 x 10^-9 bis 1,0 x 10^-5 mol/l). Es konnte die dosisabhängige Dilatation durch ACh anhand einer DWK nachvollzogen werden.

In funktionell einwandfreien Gefäßen betrug die Vasodilatation durch ACh nach PE-Vorkontraktion mindestens 60 % der Vorspannung. Wurde dieser Prozentsatz nicht erreicht, konnte von einer strukturellen Schädigung des Endothels ausgegangen werden und der Aortenring musste erneut ausgetauscht werden.

Der Versuch

Der eigentliche Versuch wurde unter einer konstanten Vorspannung der Gefäße von 12 mN durchgeführt. Da die Fähigkeit des HDL eine Relaxation auszulösen überprüft werden sollte, wurde zunächst PE in einer Konzentration von 1,0 x 10^-5 mol/l in die Kammer gegeben. Daraufhin erreichte das jeweilige Gefäß ein konstantes Kontraktions-Plateau. Es folgte die Applikation der zu untersuchenden Substanzen, in diesem Fall des HDL verschiedener Herkunft.

Um eine dosisabhängige Wirkung des Lipoproteins darstellen zu können, wurde zunächst die niedrigste Konzentration appliziert, dann in Zeitabständen von 30 min und in Schritten von 0,5 mol/l die jeweils höheren Konzentrationen. Der relevante Wirkungsbereich betrug sich auf 1,0 x 10^-9 bis 1,0 x 10^-5 mol/l.

Reinigung des Kleingefäßmyographen

Nach jedem Versuch am Kleingefäßmyographen musste die salzreiche Tyrode-Lösung vollständig aus der Kammer entfernt werden. Hierzu wurde die Kammer zunächst mehrfach mit destilliertem Wasser ausgespült. Danach wurde 8%ige Essigsäure in die Kammer eingelassen. Nach 5 Minuten folgte erneut ein Ausspülen mit destilliertem Wasser. Dieser Vorgang - erst Einlass von Essigsäure, dann Spülen - wurde dreimal wiederholt.

Da die Absaugvorrichtung nicht alle Flüssigkeit restlos aus der Kammer zu entfernen vermag, wurde am Ende des Reinigungsprozesses das restliche Wasser vom Kammerboden mit einer Spritze abgesaugt.

Im Anschluss an jeden Versuch wurde die Vaseline auf dem Verbindungsstück von Kammer zu Messeinheit erneuert. Dann wurde das Gerät sorgfältig abgedeckt um Kontaminationen durch andere im Labor verwendete Materialien zu verhindern.