Vergleichende Analyse der Operons pmoCAB1 und pmoCAB2 von Methylocystis sp. Stamm SC2

Natürlich kann auch das parallele Einwirken beider Mechanismen nicht ausgeschlossen werden.

4.1.2 Vergleichende Analyse der Operons pmoCAB1 und pmoCAB2 von

Problematik zu umgehen, wurde die Klonierung mittels BACs, die nur mit ein bis zwei Kopien pro Zelle vorliegen, durchgeführt. Eine ca. 1000 Klone umfassende BAC-Bibliothek mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 80 kb wurde mit spezifischen PCR-Assays sowohl hinsichtlich pmoA1 als auch hinsichtlich pmoA2 gescreent, jeweils ein testpositiver Klon wurde anschließend sequenziert.

Vergleich der Operonstrukturen von pMMO-1 und pMMO-2.

Die stromaufwärts bzw -abwärts des pmoA-Gens identifizierten offenen Leserahmen (ORFs) konnten eindeutig als pmoC bzw. pmoB charakterisiert werden. Die Längen dieser Gene liegen in einem Bereich, der zuvor bereits für die entsprechenden Gene zweier Typ II und eines Typ X MB berichtet worden ist (vgl. 3.1.2, Tab. 2). Der paarweise Vergleich zueinander homologer Gene ergab prozentuale Sequenz-Ähnlichkeiten derselben Größenordnung, die zuvor für das zentrale Fragment der pmoA bestimmt worden war. Daraus kann abgeleitet werden, daß alle drei Gene eine vergleichbare phylogenetische Entwicklung durchlaufen haben. Phylogenetische Analysen der Aminosäuresequenzen aller drei abgeleiteten Polypeptide bestätigen dies (vgl. 3.1.2). Im Gegensatz zu den kodierenden Bereichen wiesen die intergenischen Regionen der zwei verglichenen Operons keine signifikanten Übereinstimmungen auf. Die Zuordnung homologer Nukleotide (Alignment) dieser Bereiche war nicht möglich. Dieses Resultat unterstützt die Annahme, daß die Gene der pMMO-2 einem konservierenden evolutionären Druck unterworfen sind, der eine Akkumulation von Mutationen verhinderte, wie sie für die während des gleichen Zeitraums evolvierten intergenischen Regionen festgestellt wurde. Stromaufwärts der pmoCAB-Gene beider Operons wurden Ribosomen-Bindestellen („Shine-Dalgarno-Sequenzen") identifiziert. Die Konserviertheit dieser innerhalb der hochvariablen intergenischen Regionen gelegenen Motive deutet darauf hin, daß die Shine-Dalgarno-Sequenzen noch funktionell bedeutsam sind. Dieser Befund bereitet zusätzliche Evidenz, daß die Gene der pMMO-2 nicht nur transkribiert sondern auch translatiert werden. Beide Gencluster werden stromaufwärts durch Promoter-Bereiche (vgl. 4.1.5), stromabwärts durch Faktor-unabhängige Transkriptionsterminatoren flankiert. Alle notwendigen Elemente für Transkription und Translation konnten nachgewiesen werden. Somit wurde erstmals gezeigt, daß die Gene pmoC2, pmoA2 und pmoB2 in einem Operon organisiert sind, dessen Struktur mit der Struktur konventioneller pMMO-Operons übereinstimmt.

Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von pMMO-1 und pMMO-2 Während die Identitätswerte der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von pMMO-1 und pMMO-2 durchweg sogar unter den Identitätswerten der entsprechenden Gene liegen, wurden deutlich höhere Ähnlichkeitswerte festgestellt. Zur Berechnung der Identität wird der prozentuale Anteil identischer Aminosäuren zweier Sequenzen bestimmt. Die Ähnlichkeit ist definiert als relativer Anteil funktionell ähnlicher Aminosäuren. Es werden also alle Positionen eines Alignments gezählt, an denen die zu vergleichenden Polypeptide Aminosäurereste mit vergleichbaren physikochemischen bzw. strukturellen Eigenschaften aufweisen. Hohe Ähnlichkeitswerte deuten auf eine vergleichbare Funktion zweier Proteine hin.

Wesentlich deutlicher konnte die mögliche funktionelle Entsprechung von pMMO-1 und pMMO-2 durch die vergleichende Ableitung der Sekundärstrukturen beider Proteine dargestellt werden. Anhand verschiedener, auf statistischen Modellen ("Hidden Markov Modelle") wie auch auf der Hydrophobizität einzelner Aminosäuren basierender Analysemethoden (vgl. 2.1.3) konnten die wahrscheinlichen Sekundärstrukturen aller Polypeptide, insbesondere eine große Zahl transmembraner Helices, vorhergesagt werden. Die Sekundärstruktur von pMMO-2 stimmt hinsichtlich Anzahl und Lage der Transmembran-Regionen sowohl mit den drei bereits bekannten Sekundärstrukturen konventioneller pMMOs (Gilbert et al., 2000;

Stolyar et al., 1999) als auch im direkten Vergleich mit der Struktur der pMMO-1 von Methylocystis sp. Stamm SC2 stark überein (vgl.3.1.2, Abb. 3). Strukturelle Ähnlichkeiten gelten allgemein als starkes Indiz für ähnliche Funktionen. Das trotz der auf Ebene der Primärstrukturen von DNA und Aminosäure beobachteten prozentualen Distanzen eine große strukturelle Übereinstimmung beider Proteine besteht, muß als beträchtliche Evidenz dafür gewertet werden, daß pMMO-2 einem konservierenden evolutionären Druck unterworfen ist. Die untersuchten Gene stellen somit keine Pseudogene dar, sondern codieren für ein Enzym, das die Reaktion einer membranassoziierten Monooxygenase ausführen kann.

Dieser Befund wird unterstützt durch eine vergleichende Analyse hochkonservierter Aminosäurereste, die bei nahezu allen bekannten pMMO- und AMO-Sequenzen vorhanden sind. Dazu wurde auf die Arbeit von Tukhvatullin und Mitarbeitern (2000) zurückgegriffen, in der insgesamt 203 hochkonservierte Reste identifiziert wurden. Die Mehrzahl dieser Aminosäurereste (190) ist auch an den

homologen Positionen der pMMO-2 von Methylocystis sp. Stamm SC2 vorhanden.

Die Abweichung an 13 Positionen von einer Konsensussequenz, die sowohl für die bekannten Sequenzen der Typ I und Typ II MB als auch für Sequenzen der homologen AMO charakteristisch ist, erscheint um so erstaunlicher, da pMMO-2 phylogenetisch zusammen mit pMMO-1 Sequenzen der Typ II MB gruppiert, während die ebenfalls der Konsensussequenz zugrundeliegenden AMO-Sequenzen und pMMO-1 Sequenzen der Typ I MB deutlich getrennt verzweigen. Der Befund steht in Übereinstimmung mit der unter 4.1.1 diskutierten evolutionären Entwicklung von pMMO-2. Er gibt zu Vermutungen Anlaß, daß das Enzym eine der konventionellen pMMO zwar ähnliche, jedoch abweichende Funktion haben und beispielweise eine Anpassung an bestimmte Umweltbedingungen darstellen könnte.

Obwohl der hohe Grad an Konserviertheit darauf hindeutet, daß die von Tukhvatullin und Mitarbeitern beschriebenen Aminosäure-Reste bei der enzymatischen Reaktion eine wichtige Rolle spielen, muß nicht von einem Verlust der katalytischen Aktivität der pMMO-2 ausgegangen werden, da 12 der 13 von der Konsensussequenz abweichenden Reste der gleichen funktionellen Aminosäuren-Gruppe wie ihre konservierten homologen Gegenstücke angehören. Der Ähnlichkeits-Wert der 203 verglichenen Reste von pmoCAB2 und Konsensussequenz liegt somit über 99%.

Tukhvatullin und Mitarbeiter analysierten anhand von Struktur-Daten (Mössbauer Spektroskopie, ESR u.a.) das Potential der hochkonservierten Aminosäurereste, als Bindestellen der in der pMMO enthaltenen Metallatome zu fungieren. Solche Reste können bei der Ausbildung des aktiven Zentrums eine essentielle Rolle spielen. Von 39 konservierten, potentiell Liganden-bindenden Aminosäuren sind 38 auch in der pMMO-2 von Methylocystis sp. Stamm SC2 vorhanden. Die einzige Ausnahme (Y26->F in pmoA) ist in der Mehrzahl der vorgeschlagenen Modelle nicht an der Formation des katalytischen Zentrums beteiligt. Darüber hinaus sind Tyrosin (Y) und Phenylalanin (F) durch ähnliche strukturelle und chemische Eigenschaften charakterisiert. Deshalb muß der Austausch nicht zwangsläufig einen Einfluß auf die katalytische Aktivität der pMMO-2 gehabt haben.

Die Ableitung der Funktion einer pMMO/AMO nur aufgrund der phylogenetischen Stellung ihrer Sequenzen ist ohne Kenntnis der physiologischen Eigenschaften des Organismus nicht möglich. Beispielsweise sind die AmoA- Sequenzen nitrifizierender Gammaproteobacteria phylogenetisch näher mit PmoA-Sequenzen von Gammaproteobacteria verwandt, als mit den AmoA-Sequenzen der

Betaproteobacteria. Um die pMMO-2 funktionell gegen die AMO abzugrenzen, wurde eine Signaturanalyse durchgeführt. Der Vergleich von 919 AmoA-, 315 PmoA1- und 40 PmoA2-Sequenzen ermöglichte die Bestimmung von 18 Positionen, an denen AmoA und PmoA1 unterschiedliche Signaturen (konservierte Reste) aufweisen, die in der Gesamtheit eine Differenzierung beider Enzymfunktionen erlauben. Da die PmoA2-Konsensussequenz hohe Übereinstimmung mit den Signaturen der PmoA1 aufweist (vgl. 3.1.2, Tab. 3), wurde pMMO-2, entsprechend der bisherigen Annahmen, die Funktion einer Methan-Monooxygenase zugewiesen.

Bestimmung der Transkriptionstartpunkte mittels RACE

Durch reverse Transkription der mRNA von Methylocystis sp. Stamm SC2 konnte spezifische cDNA für beide Operonkopien generiert werden. Polyadenylierung der 3'-Enden ermöglichte die Amplifikation des 3'-terminalen Bereichs der cDNA durch Kombination Operon-spezifischer Primer mit Oligo-T-Primern. Durch anschließende Sequenzierung der Amplifikate konnte das zur ersten Base der mRNA korrespondierende 3'-Ende der cDNA basengenau festgestellt werden (vgl. 2.10.7).

Die Ergebnisse wurden anschließend mittels spezifischer PCR-Analysen überprüft und bestätigt. Stromaufwärts der Transkriptions-Startpunkte konnten sowohl für pmoCAB1 wie auch für pmoCAB2 Nukleotid-Sequenzen identifiziert werden, die hohe Ähnlichkeit zu der Konsensussequenz der –35 und –10 Elemente von E. coli- σ⁷⁰-Promotoren aufweisen. Der Bereich wurde dementsprechend als Promoter annotiert. Ein Vergleich mit den von Gilbert und Mitarbeitern bestimmten Promotoren der pmo-Operons von M. trichosporium OB3b und Methylocystis sp. M zeigte (Gilbert et al., 2000), daß die –35 und –10 Elemente konventioneller pmo-Operons untereinander eine hohe Sequenzähnlichkeit aufweisen. Der pmo2-Promoter weist deutliche Unterschiede zu diesen Sequenzen auf. Wenngleich andererseits die Ähnlichkeit aller Promotoren zur E.coli-Konsensussequenz vergleichbar ist, könnte dies ein Indiz dafür sein, daß es sich bei dem pmo2-Promoter um einen, im Vergleich zu pmo1-Promotoren, „schwachen“ Promoter handelt. Der Befund steht in Übereinstimmung mit der im Vergleich zur pMMO-1-Transkription deutlich schwächeren Transkription von pMMO-2 unter Standardwachstumsbedingungen (vgl.

4.1.6). Eine gezielte Regulation als Antwort auf veränderte Umweltbedingungen

dürfte eher durch zusätzliche Kontrollelemente erfolgen, als durch Verwendung eines alternativen σ-Faktors.

Mögliche Funktion der pMMO-2

Zusammengefaßt deuten die diskutierten Ergebnisse, insbesondere der durch verschiedene Analysen erwiesene, auf pMMO-2 wirkende Selektionsdruck, die experimentelle Darstellung der Transkription (RACE-Analysen) sowie die weite Verbreitung der pmoA2 innerhalb der Typ II MB auf eine aktive Funktion des Enzyms hin. Die Tatsache, daß pMMO-2 bei vielen MB nicht vorhanden ist, steht nicht im Widerspruch zu dieser Hypothese, da ein ähnliches Verbreitungsmuster beispielsweise auch für die funktionell wichtige sMMO bekannt ist. Die sMMO wird alternativ zur pMMO nur bei Kupferkonzentrationen unter 0,2 µM exprimiert.

Insbesondere die Abweichungen der Sequenzen von PmoCAB von der ansonsten für pMMO und AMO stark charakteristischen Konsensussequenz deuten auf eine mögliche "Spezialisierung" der pMMO-2 hin. Allerdings können über die genaue Funktion der pMMO-2, insbesondere über die Unterschiede zur konventionellen pMMO-1, nur Vermutungen angestellt werden. Ein erster Versuch zur Bestimmung der funktionellen Besonderheiten wurde mit einer im Rahmen dieser Promotion angeleiteten Diplomarbeit von Viola Paulus unternommen (Paulus, 2004).

Darin wurde mittels spezifischer Amplifikation von cDNA das relative Verhältnis der Transkripte beider pmo-Operons unter verschiedenen Wachstumsbedingungen getestet. Ein so detektierter Anstieg des pmoCAB2-Transkriptions-Niveaus bei Kultivierung von Methylocystis sp. Stamm SC2 unter verminderter Sauerstoff-Konzentration (1% O2 statt 21% unter Standardbedingungen) konnte jedoch durch direkten Nachweis der mRNA mittels Northern-Hybridisierung nicht bestätigt werden. Dennoch werden die Ergebnisse als erster Hinweis auf eine verstärkte Expression der pMMO-2 unter in situ Bedingungen gewertet. Die in natürlichen Habitaten gemessenen O2-Konzentrationen der oxisch/anoxischen Grenzschichten liegen in der Regel deutlich unter 1 %, konnten im Labor jedoch nicht reproduziert werden.

Zwar konnte die Expression von pmoCAB2 unter allen getesteten Wachstumsbedingungen nachgewiesen werden, von Paulus bzw. im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführte semiquantitative Analysen ergaben jedoch stets ein

deutlich geringeres Transkriptionsniveau als für pmoCAB1. Ob pMMO-2 eine von der pMMO-1 (leicht) abweichende Funktion aufweist und als Isoenzym eine Anpassung an bestimmte Umweltfaktoren darstellt, kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht eindeutig geklärt werden. Die Frage wird frühestens mit dem Abschluß von unlängst begonnenen Studien beantwortet werden können, die die Auswirkungen des gezielten Ausschaltens sowohl der konventionellen als auch der neuartigen Form der pMMO (Analyse von Knockout-Mutanten) untersuchen.