3 ERGEBNISSE
3.3 CYTOKININ-OXIDASE/DEHYDROGENASE
3.3.2 ÜBEREXPRESSION VON AtCKX2 IN Physcomitrella
3.3.2.8 Beschreibung von Wachstum und Phänotyp der tCKX-Transformanten
werden muss, dass bei tCKX7 und tCKX16 die gewünschte CKX-Überexpression vorliegt, wurden phänotypische Untersuchungen auf mehreren Ebenen durchgeführt.
3.3.2.8.1 Biomasseproduktion unter Flüssigkulturbedingungen
Die Genotypen tCKX7 und tCKX16 sowie der Wildtyp wurden im A’BCDTV-Medium in Triplikaten unter Flüssigkulturbedingungen kultiviert. Zu Versuchsbeginn sowie an den Tagen 10 und 20 wurde das Trockengewicht des jeweils in 200 ml Medium gewachsenen Gewebes bestimmt (2.11.2). Alle drei Genotypen zeigen im zeitlichen Verlauf eine vergleichbare Biomasseproduktion (s. Abb. 3.24).
WACHSTUMSENTWICKLUNG
0 50 100 150 200
0 5 10 15 20
Tagen Wildtyp tCKX7 tCKX16
Trockenmasse (mg)
Wie in Abb. 3.25 wiedergegeben, lag bei allen drei Genotypen zum Zeitpunkt T0 ausschließlich Protonema vor, welches wie bei T10 und T20 zu Gametophoren weiterdifferenzierte. Allerdings waren Unterschiede in der Ausprägung der verschiedenen Gewebe (Form, Größe, Anzahl) zu erkennen, die in den Kapiteln 3.3.2.8.2 und 3.3.2.8.3 dargestellt und bewertet werden.
100µm
Wildtyp tCKX7 tCKX16
T0
T10
T20
Abb. 3.25 Mikroskopische Aufnahmen von Wildtyp, tCKX7 und tCKX16 aus Flüssigkulturen.
Probenahmen an Tagen T0, T10 und T20. Die Größenbalken entsprechen 100 µm.
Abb. 3.24 Biomasseproduktion von Wildtyp, tCKX7 und tCKX16 unter Flüssigkulturbedingungen im zeitlichen Verlauf. Die Daten entsprechen Mittelwerten mit Standardabweichungen von drei Kulturen je Genotyp.
Die Integration und Überexpression von AtCKX2 bei den tCKX-Transformantanten zeigten eine erhöhte CKX-Aktivität, insbesondere im Kulturmedium. Die Auswirkungen der erhöhten CKX-Aktivität auf den Phänotyp wurden auf verschiedenen Ebenen untersucht: Protonema, Gametophoren, Rhizoide, Phylloide.
Zusätzlich wurde überprüft, ob die Fähigkeit zur generativen Vermehrung beeinträchtigt war.
3.3.2.8.2 Protonema
Für die Erfassung von Größenunterschieden bei Protonemazellen wurden Flüssig- Kulturen verwendet, die bei 25°C in 1-Liter Schottflaschen gehalten worden waren (s. 2.11.2). Insgesamt wurden 100 Protonemazellen pro Genotyp vermessen. Die Messung von Zelllänge und -breite erfolgte immer an der Mitte der Querwände bzw.
an den Längsseiten der Zellen, unabhängig von der Zellform. Wachsende Apikalzellen waren von dieser Untersuchung ausgenommen.
Zuerst wurden die mittlere Zelllänge und -breite für den Wildtyp ermittelt. Als Standard wurden Werte betrachtet, die mindestens bei 10% der vermessenen Zellen vorkamen. Hierbei wurde eine Zelllänge zwischen 60 und 99 µm und eine Zellbreite zwischen 18 und 29 µm bestimmt. Vereinzelt konnten Zell-Abmessungen außerhalb dieser Bereiche gemessen werden (s. Abb. 3.26 links).
Breite
0 14 28 42 56 70
0 25 50 75 100 125 150
Wildtyp
0 25 50 75 100 125 150
tCKX7
Länge
0 25 50 75 100 125 150
tCKX16
Abb. 3.26 Darstellung der Länge und Breite von 100 vermessenen Protonema Zellen von Wildtyp, tCKX7 und tCKX16. Als Inserts sind, oben links, typische Protonema-Zellen der jeweiligen Genotypen abgebildet (Größenbalken entsprichen 75 µm).
Die Zellen der Transformanten zeigen eine Länge von 20 bis 160 µm; für die Breite wurden Werte von 14 bis 60 µm gemessen. Wenn man einer Reihe von Zellen eines Protonema-Fadens folgte, konnte man gelegentlich eine Inversion von Länge und
Breite beobachten, so dass vereinzelte Zellen einen runden anstatt länglichen Habitus zeigten (vgl. ebenfalls Abb. 3.25, T0).
Tab. 19 Prozentuale Verteilung der Zelllänge und -breite bei Protonema von Wildtyp, tCKX7 und tCKX16.
LÄNGE (%) BREITE (%)
< 60 µm 60-99 µm > 99 µm GENOTYP
< 18 µm 18-29 µm > 29 µm
4,0 85,0 11,0 Wildtyp 3 93,0 4,0
16,0 71,9 12,5 tCKX7 0 65,5 34,4
28,0 46,0 25,0 tCKX16 0 43,8 56,3
Die statistische Verteilung der Zellabmessungen der Transformanten unterschied sich von der des Wildtyps. Bei beiden Transformanten konnte man im Vergleich zum Wildtyp eine Tendenz zur Bildung von breiteren Zellen beobachten (Abb. 3.26).
Während beim Wildtyp das Auftreten von breiteren Zellen (breiter als 29 µm) nur bei 4% lag, kamen solche Zellen bei den Transformanten (tCKX7 und tCKX16)mit einer Häufigkeit von 34,4% bzw. 56,3% vor (s. Tab. 19).
Die Länge der Zellen bei den Transformanten unterschied sich im Vergleich zum Wildtyp ebenfalls, allerdings zeigte sich die Veränderung bei tCKX16 stärker als bei tCKX7. Bei tCKX7 konnte man eine verstärkte Bildung von kürzeren Zellen (unter 60 µm) beobachten, mit einem Vorkommen von 16% im Vergleich zu 4% beim Wildtyp.
Bei tCKX16 sah man im Vergleich zum Willdtyp sowohl verküzte als auch verlängerte Zellen, wobei die kürzeren Zellen mit einer Häufigkeit von 28%
vorkamen. Die längeren Zellen (> 99 µm) kamen bei tCKX7 mit einer Häufigkeit von 25% vor, beim Wildtyp jedoch nur mit einer Häufigkeit von 11%. (vgl. Tab. 19).
3.3.2.8.3 Gametophoren und Rhizoide
Um Veränderungen bei den Gametophoren und Rhizoiden feststellen zu können, wurden Pflanzen verwendet, die auf Agarmedium bei 15°C und 25°C gewachsen waren (s. 2.5.1). Nach zweimonatigem Wachstum in Glasgefäßen wurden 13 Pflanzen auf eine mit Millimeter-Papier skalierte Folie gelegt und vermessen. Sowohl bei Gametophoren als auch bei Rhizoiden wurden die jeweiligen maximalen Längen gemessen.
Die Größe der Gametophoren beim Wildtyp unterschied sich bei beiden Wachstumstemperaturen nicht. Die Rhizoide hingegen zeigten bei 15°C ein stärkeres Wachstum und waren doppelt so lang wie bei Pflanzen, die bei 25°C gewachsen waren. Die Anzuchttemperatur wirkt sich also deutlich auf die Länge der Rhizoide aus.
Abb. 3.27 Links: Darstellung der Länge der Gametophoren von Wildtyp, tCKX7 und tCKX16 bei jeweils 15°C und 25°C. Rechts: Länge der Rhizoide von WT, tCKX7 und tCKX16 bei jeweils 15°C und 25°C. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen für mindestens 13 vermessene Pflanzen je Genotyp.
Bei den Transformanten traten genauso wie beim Wildtyp bei der Länge der Gametophoren keine signifikanten Abweichungen zwischen beiden Temperaturen auf (s. Abb. 3.27 links). Wenn man die Gametophorengröße der beiden Transformanten mit der des Wildtyps vergleicht, ist keine deutliche Tendenz zu beobachten: Während bei tCKX7 für beide Temperaturen die Gametophoren einer Größe von 45% bzw. 63% des Wildtyps zeigten (15° bzw. 25°C), waren tCKX16 Gametophoren ähnlich groß wie der Wildtyp.
Im Unterschied zum Wildtyp zeigten beide Transformanten bei der Länge der Rhizoide keine Temperaturabhängigkeit (s. Abb. 3.27 rechts). Bei 15°C war die mittlere Länge der Rhizoide bei tCKX7 länger als beim Wildtyp, die für tCKX16 dagegen kürzer.
Auffallend war bei 25°C, dass die Rhizoide der Transformanten tCKX7 und tCKX16 3,5- bzw. 1,4-fach länger als beim Wildtyp waren.
Länge der Rhizoide
WT tpCKX7 tpCKX16 Länge der Gam etophoren 25°C
0 2 4 6 8 10 12 14
WT tpCKX7 tpCKX16 mm
15°C
Wildtyp tCKX7 tCKX16 Wildtyp tCKX7 tCKX16
3.3.2.8.4 Vergilbung der Phylloide
Die tCKX-Transformanten zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine verfrühte Vergilbung der Phylloide. Bereits nach 5 Wochen wurden Vergilbungen beobachtet, die in der Regel an der Basis des Cauloids begannen. In Abb. 3.28 sind 12 Wochen alte Pflanzen dargestellt. Zu diesem Zeitpunkt zeigte der Wildtyp (links) sowohl im unteren als auch im oberen Teil des Gametophors die charakteristische grüne Farbe. tCKX7 hingegen zeigte durchgehend bei allen Gametophoren Vergilbungen.
tCKX16 war weniger vergilbt, obwohl in der Mitte der Gametophoren bereits dunkle Punkte zu erkennen waren. Wenn man die einzelnen Gametophoren betrachtet (untere Bilder), wird die bei den Transformanten auftretende starke Vergilbung der Phylloide im Vergleich zum Wildtyp deutlich.
Abb. 3.28 Darstellung von Gametophoren von Wildtyp, tCKX7 und tCKX16 nach 12 wöchigem Wachstum auf ABCTV-Medium bei 15°C (s. 2.5.1). Oben: Aufsicht auf Physcomitrella Kulturen.
Unten: Exemplarisch isolierte Gametophoren; der Wildtyp zeigt die typisch grüne Farbe der Phylloide.
Die Transformanten zeigen dagegen Vergilbungen an Phylloiden sowie die Bildung mittelständiger Rhizoide am Cauloid.
Gelegentlich konnte man am Cauloid der tCKX-Transformanten, ähnlich wie bei PpADK1-Transformanten (s. 3.2.2.5.3), mittelständige Rhizoide erkennen.
3.3.2.8.5 Generative Fortpflanzung
Mehrere Kreuzungsversuche sowie Versuche zur Induktion von Sporophyten wurden durchgeführt, um die Fertilität beider Transformanten zu überprüfen (s. 2.12.1).
Hierbei konnte in keinem Fall die Bildung von Sporophyten beobachtet werden.
Weder nach der Kreuzung mit dem Wildtyp, noch mit der nicBS-Mutante, welche männlich steril sind (Schaefer et al., 1991), konnten Antheridien, Archegonien oder Sporophyten beobachtet werden, sodass folglich der Lebenszyklus der Transformanten auf die vegetative Vermehrung beschränkt ist.
3.3.2.9 Verteilung der endogenen Cytokinine bei den tCKX-Transformanten