PCR – Direktnachweis von MRSA
5.4 Vergleich der Kultur mit der PCR
Der Vergleich beider Methoden miteinander ergibt, dass jede seine Vorteile und Nachteile hat. Die konventionelle Kulturmethode wird heutzutage als Goldstandard angesehen. Allerdings benötigt der MRSA-Erregernachweis über konventionelle Kulturverfahren mindestens 24 Stunden, meistens aber zwischen 48-72 Stunden bis das Ergebnis bekannt wird. Dieser Zeitrahmen bedeutet bei vorsorglicher Isolierung des Patienten bis zu 3 Tage Isolierung, was mit psychischer Belastung für den Patienten, Belastung fürs Personal und zusätzlichen Kosten für das Krankenhaus einhergeht. Insbesondere auf Intensivstationen, wo Patienten unter ständiger Überwachung und Pflege stehen, sind die oben genannten Faktoren durch eine unnötige Isolierung verstärkt.
Wird der Patient nicht isoliert, wie es häufig vorkommt, bedeutet diese Zeit die Möglichkeit für den Keim, sich auch auf benachbarte Patienten und Personal auszubreiten und im schlimmsten Fall einen MRSA-Ausbruch auszulösen.
Die neuen chromogenen Medien stellen einen guten Ansatz da, den kulturellen Nachweis zu beschleunigen. Mit der Unterstützung eines zusätzlich durchgeführten Latex-Agglutinationstests können sehr
einsparen, da manche Kolonien erst nach 48 Stunden sichtbar wurden.
Damit könnte auch erst zu dem Zeitpunkt der eindeutige S.aureus Nachweis durchgeführt und befundet werden.
Die am LightCycler 480 durchgeführte PCR benötigte ca.1.5 Stunden.
Die zuvor durchzuführenden DNA-Isolierungsmethoden nahmen abhängig von der Probenanzahl 1.5 bis 2.5 Stunden in Anspruch.
Somit lag das Ergebnis des Nukleinsäure-gestützten Direktnachweises von MRSA ca. 3–4 Stunden nach Probeneingang vor. Im Vergleich zur kulturellen Diagnostik ist das eine enorme Zeiteinsparung. Durch ein so schnelles Vorliegen der Ergebnisse treten die zuvor beschriebenen Risiken, durch einen um Tage verzögerten Befund, in diesem Fall nicht auf. Auch ambulante Patienten können nach kurzer Wartezeit mithilfe der PCR- Diagnostik untersucht werden, ohne tagelang auf das Ergebnis warten zu müssen.
Die erzielten Ergebnisse hinsichtlich Sensitivität, Spezifität, negativem Prädiktionswert und positivem Prädiktionswert reichen aus, um eine Infektion bzw. Besiedelung mit MRSA auszuschließen, nicht aber, um diese mit absolut hoher Sicherheit zu bestätigen. Dieser Umstand macht einen zusätzlichen kulturellen Nachweis nötig. Auch ist es problematisch, wenn aufgrund der vermeintlich hohen Sensitivität PCR-Ergebnisse zur Aufhebung von Isolierungsmaßnahmen herangezogen werden, da die Methode auch bei inaktiven Keimen bzw. noch Tage bis Wochen nach erfolgreicher Eradikationsbehandlung zu positiven
DNA-Um das Resistenzverhalten der Erreger zu untersuchen, kann die PCR die Kultur allerdings nicht ersetzen. Aber auch bei Einsatz neuerer chromogener Medien kann der Schritt der konventionellen Resistenztestung nicht umgangen werden.
5.5 Kosteneffizienz
Um die kulturellen und die Nukleinsäure-gestützten Nachweisverfahren für MRSA gegeneinander abzuwägen kann der Kostenfaktor nicht ungeachtet bleiben. Bei Betrachtung der Kosten allein für das Material der Tests ergibt sich ein klarer Vorteil der kulturellen Methode gegenüber dem PCR-gestützten Verfahren. Allein Anschaffungskosten von mehreren Zehntausend Euro für die Geräte zur DNA-Isolierung und PCR zeigt einen deutlichen Mehraufwand.
Um die Kosteneffizienz der beiden Nachweismethoden abzuwägen, reicht es nicht aus sich die Kosten für die einzelnen Tests zu betrachten.
Eine Studie von Conterno et al. konnte in einer präzisen Analyse zeigen, dass die Kostendifferenz beider Methoden nur relativ gering ist, wenn man sich die Kosten eines MRSA-Ausbruchs betrachtet, die wie in der Aufstellung nach M.Kanerva et al. im 7-stelligen Euro Bereich lagen. Um solche Ausbrüche zu verhindern, ist ein umfangreiches und schnelles Screening nötig. Bei hoher Inzidenzrate, wie bei einem Ausbruch oder auch auf vielen Intensivstationen, gilt der schnelle PCR-gestützte Nachweis, als kosteneffektiv (22). Für ein generelles Screening bei niedriger Inzidenzrate hat der PCR-gestützte Nachweis
eine noch so schnelle Diagnostik bringt wenig, wenn die nötigen Hygienemaßnahmen nicht eingehalten werden, um eine Ausbreitung innerhalb der Stationen zu verhindern. Besonders auf den Intensivstationen, welche das größte Einsatzgebiet der PCR-gestützten Schnelltests darstellen, ist die Umsetzung der strikten Hygienemaßnahmen bei gleichbleibender intensiver Pflege oft eine Herausforderung (15).
6. Zusammenfassung
Die besorgniserregende MRSA-Inzidenz in Deutschland erfordert neue Strategien. Insbesondere in Sachen Prävention müssen Veränderungen stattfinden, da sie im Kampf gegen MRSA eine entscheidende Rolle spielt. Das beinhaltet u.a. ein striktes Screening, um bei MRSA-positiven Patienten schnellstmöglich Schutzisolierung sowie Therapiemaßnahmen einzuleiten. Damit soll eine weitere Ausbreitung auf Personal und andere Patienten verhindert werden.
Neuentwicklungen auf dem Gebiet der Diagnostik wollen diesen Forderungen nachgehen.
Zum einen sollen neue chromogene Medien den kulturellen Nachweis von 72-48 Stunden auf 24 Stunden verkürzen und durch selektives Wachstum die Identifizierung von MRSA vereinfachen.
Andererseits zeigen Fortschritte in der PCR-Diagnostik, dass gute Ergebnisse auch schon nach 2,5 Stunden vorliegen können.
In unsere Studie wurden beide Verfahren miteinander verglichen. Es wurde ein SCCmec PCR-Nachweis am LightCyler 480 durchgeführt und gleichzeitig CHROMagar™ MRSA Selektivplatten mit dem Probenmaterial beimpft. Als Referenz fand parallel ein konventioneller Kulturnachweis auf Blutagar- und Mannit-Platten statt.
Der CHROMagar™ konnte erst nach Bestätigung der verdächtigen Kolonien durch den Staphaurex ® -Agglutinationstest ein zuverlässiges Ergebnis liefern. Allerdings galt das erst nach 48 Stunden Bebrütung.
Somit ging der erwartete Zeitvorteil gegenüber der konventionellen
Methode weitgehend verloren. Insgesamt betrachtet stellt der CHROMagar™ MRSA jedoch in mikrobiologischen Laboratorien ohne molekulare Diagnostik eine hilfreiche und einfache Alternative zu konventionellen Nachweisverfahren dar.
Eine enorme Zeiteinsparung konnten wir dagegen mit dem PCR-gestützten Nachweis erzielen. Man erhielt innerhalb von 2,5 – 3,5 Stunden gute und aussagekräftige Ergebnisse, die ausreichten, um MRSA sicher auszuschließen. Nur bei den Kosten pro durchgeführten Test konnte der PCR- Nachweis nicht mit konventionellen Methoden konkurrieren. Bei einem zirka zehnfach höheren Kostenaufwand gegenüber den Kulturverfahren sind die Anwendungsbereiche noch eingeschränkt. Allerdings bleiben bei einem bloßen Vergleich der reinen Material- und Personalkosten diejenigen gesamtökonomischen Einsparungen in einem Krankenhaus, die mit der Schnelligkeit der PCR-gestützten Nachweisverfahren und der damit verbunden schnellen Befundübermittlung verbunden sind, weitgehend unberücksichtigt.
Die Frage nach dem optimalen Nachweisverfahren für MRSA lässt sich abschließend nicht so leicht beantworten. Sowohl PCR-gestützte wie auch neue kulturelle Verfahren finden heutzutage, abhängig von Klinik und Labor, ihre sinnvollen Anwendungs- und Einsatzgebiete. Der PCR-gestützte Nachweis ist zwar deutlich schneller, allerdings schränken bislang die höheren Kosten vielerorts den Einsatz ein.
7. Anhang
7.1 Literatutverzeichnis
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7.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: MRSA Prävalenz von 1990-2004 Abbildung 2: Ablauf einer PCR
Abbildung 3: Sensitivität für den MRSA-Nachweis nach Abstrichort (34)
Abbildung 4: Übersichtsschema des PCR – Direktnachweises Abbildung 5: PCR -Temperaturzyklus im LightCycler 480 Abbildung 6: Amplifikationskurven mit linear-logarithmischem Anstieg
Abbildung 7: Schmelzkurvendiagramm des mecA-Gen Nachweises mit zwei S.aureus positiven Proben Abbildung 8: Amplifikationskurve mit unauffälliger Positiv- und Negativkontrolle
7.3 Tabellenverzeichnis
Tab 1: Durch S. aureus und MRSA verursachte Krankheitsbilder
Tab.2: Ergebnisse der Referenzkultur Tab.3: Mischkolonisation
Tab.4: CHROMagar™ MRSA nach 24 Stunden Tab.5: CHROMagar™ MRSA im Vergleich mit der
Tab.6: CHROMagar™ MRSA nach 48 Stunden Tab.7: CHROMagar™MRSA im Vergleich mit der Referenzkultur nach 48 Stunden
Tab.8: Ergebnisse Staphaurex®-Test nach 48 Stunden Tab.9: Vergleich CHROMagar™MRSA nach Staphaurex®- Test mit Referenzkultur
Tab.10: Besiedelung der falsch-positiven Proben der CHROMagar™Platten
Tab.11: Vergleich der PCR mit der Referenzkultur
7.4 Abkürzungsverzeichnis ATM: Aztreonam
cMRSA: community-acquire Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
Cp –Wert: Crossing-Point
KONS: koagulase-negative Staphylokokken
MRSA: Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus MSSA: Methicillin-sensibler Staphylococcus aureus
NCLLS: National Committee of Clinical Laboratory Standard PB 2a: Penicillin- binding- Protein 2a
PCR: Polymerase-chain-reaction S.E.T.S.: Swab Extraction Tube System
8 Lebenslauf
Name: Silvia Melanie Grundei Geboren: 20.08.1982
Geburtsort: Bayreuth
20.08.1982 : Geboren in Bayreuth/Deutschland 1989 -1993 : Besuch der Grundschule Meyernberg in Bayreuth
1993 -2002 : Besuch des Graf -Münster -Gymnasium in Bayreuth
Abschluss : Abitur
April 2003 : Beginn des Zahnmedizinstudiums an der Universität Regensburg
19.03.04: Naturwissenschaftliche Vorprüfung 28.09.05: Zahnärztliche Vorprüfung
18.06.08 : Staatsexamen der Zahnmedizin 24.09.08 : Approbation als Zahnärztin
seit 01.03.09: Vorbereitungsassistentin in der Zahnarztpraxis
VATER: BERNHARD GRUNDEI GEBOREN: 04.02.1949 BERUF: MEDIZINPHYSIKER
MUTTER: NELIDA GRUNDEI BERUF: ZAHNÄRZTIN
BRUDER: ALEXANDER NIKOLAS GRUNDEI Geboren: 14.02.84
9 Danksagung
Ich danke allen, die mir diese Arbeit ermöglicht und mich dabei unterstützt haben.
Besonderen Dank gilt PD Dr. Udo Reischl, der mich durch diese Arbeit begleitet hat und immer ein offenes Ohr für mich hatte.
Desweiteren möchte ich Anke Behr danken, die mich im Labor tatkräftig unterstützt hat. Durch sie wurde sogar die Laborarbeit am Wochenende zum Vergnügen.
Auch Markus Bollwein möchte ich danken, der mich besonders zum Ende der Arbeit mit seinem Fachwissen unterstützt hat.
Ein kleines Dankeschön auch an meinen Kollegen Michael Hansen, der mich zu Beginn in die Thematik eingeführt und mit der Praxis vertraut gemacht hat.
Abschließend möchte ich meinen Eltern von Herzen danken, die mir