3. Ergebnisse, Diskussion und Ausblick
3.2. Charakterisierung des Sulforhodamin B bindenden RNA-Aptamers
3.2.11. Vergleich des Sulforhodamin B-SRB2m und PBV-SRB2m-Komplexes
3.2.11. Vergleich des Sulforhodamin B-SRB2m und
Detektionskanal, einen mit dem SRB2m-PBV-Komplex übereinstimmenden hydro-dynamischen Radius aufweist. Der mittels FCS detektierte Unterschied in den molekularen Größen der SRB2m-RNA im Komplex mit PBV und Sulforhodamin B wurde somit nachweislich durch unterschiedliche RNA-Fluorophor-Wechselwirkungen verursacht.
3.2.12. Zusammenfassende Darstellung zum Sulforhodamin B und PBV bindenden RNA-Aptamer
Fluorophor bindende RNA-Aptamere können für die RNA-Markierung ein Analogon zur GFP-Markierung darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Anwendbarkeit des minimierten Sulforhodamin B bindenden RNA-Aptamers in der RNA-Markierung mittels FCS analysiert.
3.2.12.1. Die Detektion des Sulforhodamin B-SRB2m-Komplexes mittels FCS
Sulforhodamin B wies im SRB2m-Komplex eine 4-fach erhöhte Diffusionszeit auf. Die Konzentrationen von freiem und an das Aptamer gebundenem Sulforhodamin B konnten mittels eines Fitting-Modelles für zwei unterschiedliche Diffusionsspezies bestimmt werden.
In Titrationsexperimenten wurde eine Dissoziationskonstante des SRB2m-Sulforhodamin B-Komplexes von 238 ± 42 nM berechnet, die mit Literaturwerten übereinstimmte. Die molekulare Zählrate von Sulforhodamin B erhöhte sich nach Bindung an das RNA-Aptamer nur geringfügig, wies jedoch eine deutliche Verschiebung des Emissionsspektrums hin zu längerwelligeren Wellenlängen auf. Eine erhöhte Tendenz zu Photobleichen äußerte sich in der Verringerung der Zählrate um ein Drittel. Dieses Phänomen konnte durch erheblich verringerte Messzeit und Laserenergie nicht gemindert werden. Die Mobilität des Komplexes (D = 0,73 x 10-10 ± 0,02 x 10-10 m2s-1) wurde durch das Photobleichen jedoch nicht signifikant verändert. Eine Veränderung der molekularen Zählrate und der Diffusionszeit konnte nach Verwendung eines gegen Fluoreszein selektierten RNA-Aptamers nicht festgestellt werden.
Dies deutet auf eine hohe Spezifität der Bindung von Sulforhodamin B an SRB2m hin.
Sulforhodamin B ist in Kombination mit dem RNA-Aptamer SRB2m aufgrund der geringen Abweichungen der experimentellen von der gefitteten Autokorrelationsfunktion und der hohen Übereinstimmung der Dissoziationskonstanten mit veröffentlichten Werten zur exakten Bestimmung der Mobilität in FCS-Messungen geeignet. An RNA gebundenes und freies Fluorophor konnten in Zellextrakten durch ihre Mobilitäten voneinander unterschieden werden. Die ausgeprägte unspezifische Wechselwirkung mit zellulären Komponenten in lebenden Zellen lässt jedoch eine Anwendung von Sulforhodamin B in vivo als problematisch erscheinen.
Im Rahmen einer Zusammenarbeit wurde in RNA-Fusionskonstrukten von etwa 280 Nukleotiden ein Erhalt der Affinität zu Sulforhodamin B bei vergleichbaren photochemischen
Eigenschaften der Fluorophore festgestellt. Die Anwendung des RNA-Aptamers in kleineren Fusionskonstrukten in vitro ist somit möglich. Bei einem etwa 2.000 Nukleotide enthaltenden RNA-Fusionskonstrukt wurde eine etwa fünffach verringerte Affinität zu Sulforhodamin B bestimmt. Diese Beobachtung beschränkt die Anwendung von SRB2m und Sulforhodamin B auf Fusionskonstrukte von weniger als 2.000 Nukleotiden.
3.2.12.2. Die Detektion des PBV-SRB2m-Komplexes mittels FCS
In der veröffentlichten Studie über SRB-2 und PBV war das ungebundene PBV detektierbar.
In FCS-Messungen wurde hingegen ein zu vernachlässigendes Signal von ungebundenen PBV festgestellt. Das minimierte Aptamer SRB2m2 wurde in Titrationsexperimenten zu PBV gegeben. Dabei wurde eine Erhöhung der Zählrate, der molekularen Zählrate und der Partikelzahl in Abhängigkeit von der SRB2m2-Konzentration festgestellt. Die Diffusionszeit war nahezu konstant. Es wurde somit mittels FCS ausschließlich der SRB2m2-PBV-Komplex detektiert, der eine Diffusionskonstante von 1,11 ± 0,01 m2 s-1 aufwies. Der SRB2m-PBV-Komplex ergab mit 1,18 ± 0,04 m2 s-1 eine ähnliche Mobilität. Vergleichbare Konzentrationen von tRNA verursachten keine signifikante Erhöhung der Zählrate oder der molekularen Zählrate von PBV. Dies deutet auf eine spezifische Bindung von PBV an SRB2m2 und SRB2m in vitro hin. Mittels Zählrate und der Partikelzahl im Detektionsvolumen wurde eine Dissoziationskonstante des SRB2m2-PBV-Komplexes von 32 ± 3 und 19 ± 2 µM errechnet.
Die erheblich erhöhte molekulare Zählrate von PBV nach Bindung an SRB2m(2) und die Nichtdetektierbarkeit von ungebundenem PBV ermöglichten FCS-Messungen des Komplexes mit einem zu vernachlässigenden Hintergrund-Signal. PBV kann in Kombination mit dem RNA-Aptamer SRB2m(2) deshalb als Analogon zur Proteinmarkierung mittels der Tetracystein-Sequenz und eines Fluoreszeinderivates oder mittels GFP verstanden werden.
Die durchschnittlichen Dissoziationskonstanten des SRB2m2-PBV-Komplexes von 26 µM und des SRB2m-PBV-Komplexes von 25 µM lagen in der Größenordnung der veröffentlichten Dissoziationskonstante des SRB-2-PBV-Komplexes von 23 µM. Daraus ergibt sich eine sehr hohe RNA-Konzentration, um geringste PBV-Konzentrationen sichtbar zu machen. Das relativ schwache Signal des PBV-SRB2m-Komplexes, das sich in einer durchschnittlichen molekularen Zählrate von 8 kHz ausdrückt, weist zusammen mit der langen Relaxationszeit des Triplettzustands darauf hin, dass sich PBV im Grenzbereich der Eignung für FCS-Messungen befindet. Obwohl gezeigt werden konnte, dass PBV durch die Zellmembran diffundiert, verhindern die ausgeprägte unspezifische Wechselwirkung mit zellulären Komponenten und die geringe Affinität zu SRB2m(2) eine Anwendung von PBV in Zellextrakten und in vivo.
3.2.12.3. Strukturbiochemische Charakterisierung von SRB2m und der Fluorophor-SRB2m-Komplexe
Die molekulare Größe des Fluorophor-RNA-Komplexes, die v.a. durch die RNA bestimmt wird, konnte mittels FCS charakterisiert werden. Der hydrodynamische Radius rH von SRB2m betrug im Komplex mit PBV 1,9 ± 0,1 nm und mit Sulforhodamin B 2,9 ± 0,1 nm.
Mittels Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie wurde von monomerem SRB2m ein rH von 2,1 ± 0,1 nm bestimmt. Die Hypothese einer durch PBV verursachten Reduktion der molekularen Größe der RNA, die verbunden ist mit einer Auftrennung in Monomere, konnte in Experimenten mit Roentgenkleinwinkelstreuung (RKWS) bestätigt werden. Mittels RKWS wurde eine signifikante Reduktion des Trägheitsradius der SRB2m-RNA nach Bindung an PBV gemessen. Ungebundene RNA wies einen Dimer-Anteil von 73 % und einen Monomer-Anteil von 27 % auf. Die Wechselwirkung mit Sulforhodamin B führte zu einer Reduktion des Dimer-Anteils auf 42 %. Die Wechselwirkung mit PBV verursachte eine vollständige Auftrennung der Dimere in Monomere. Das Gleichgewicht zwischen Dimer und Monomer wurde demzufolge durch die Wechselwirkung der RNA mit PBV und Sulforhodamin B unterschiedlich stark verändert. Eine helikale und eine globuläre Domäne der SRB2m-RNA wurden identifiziert. Keine signifikante konformationelle Änderung wurde nach Bindung der Fluorophore registriert. Trägheitsradien und hydrodynamische Radien befanden sich in derselben Größenordnung. Die Trägheitsradien wiesen jedoch einen geringeren Unterschied zwischen dem PBV-SRB2m-Komplex und Sulforhodamin-PBV-Komplex auf als die hydrodynamischen Radien.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit RNA-Fluorophor-Wechselwirkungen in funktionellen, photochemischen und strukturbiochemischen Aspekten beleuchtet werden. Erstmalig wurde eine Erhöhung der Triplettzeit eines Fluorophors durch die Wechselwirkung mit RNA gefunden und die Dissoziationskonstante mit Hilfe dieses Parameters bestimmt. Die Eignung des PBV und Sulforhodamin B bindenden RNA-Aptamers SRB2m für FCS wurde überprüft.
Für die Charakterisierung von rekombinanter RNA in vitro steht in Gestalt des Sulforhodamin B und PBV bindenden RNA-Aptamers eine interessante Alternative zu bereits etablierten Methoden der indirekten RNA-Markierung zur Verfügung.
3.2.13. Ausblick zum Sulforhodamin B und PBV bindenden Aptamer
Mit dem Ziel einer hochaufgelösten strukturbiochemischen Charakterisierung des SRB2m-Sulforhodamin B-Komplexes wurden Kristallisationsansätze vorgenommen. Die Kristallisationsbedingung, mit der stabförmige Kristalle erhalten wurden, erfordert jedoch weitere Optimierung um roentgenkristallograhpisch analysierbare Kristalle zu erhalten.
Die Komplexe aus SRB2m und Sulforhodamin B bzw. PBV wiesen eine geringere molekulare Zählrate als die Atto647N-markierte RNA, die in Kapitel 3.1. verwendet wurde, auf. Es könnten deshalb für die Selektion von Fluorophor bindenden RNA-Aptameren photostabilere Fluorophore als PBV und Sulforhodamin B eingesetzt werden.
Die Tendenz von Sulforhodamin B und PBV, unspezifisch Proteine zu binden, lässt eine in vivo-Anwendung als problematisch erscheinen. Als Target für RNA-Aptamere wären dementsprechend Fluorophore geeignet, die nicht unspezifisch an zelluläre Komponenten binden. Ein Aptamer, das mit sehr hoher Affinität und Spezifität an ein photostabiles Fluorophor bände, welches zudem effizient Photonen absorbierte und emittierte, wäre eine ernstzunehmende Alternative für die RNA-Charakterisierung in vitro und in vivo.
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