Veränderung der Empfindlichkeit der Bodenmikroflora gegenüber PEITC, PPN und SCN in Abhängigkeit von der Vorbehandlung

Dem folgenden Versuch liegt die Fragestellung zu Grunde, in wie weit sich die Bodenmikroflora an eine hohe PEITC-Konzentration, bzw. an eine hohe Konzentration der verwandten Substanzen PPN und NaSCN, im Boden anpassen kann und ob sich eine solche Anpassung mit Hilfe eines physiologischen Testes nachweisen lässt.

Die 10^-2 Verdünnungen von zweimalig mit wässriger PEITC-, PPN- und NaSCN-Lösung behandelten Bodenproben werden auf Mikrotiterplatten mit steigenden PEITC-, PPN- und NaSCN-Konzentrationen in der Nährlösung mit Glucose als Kohlenstoffquelle aufgetragen.

Parallel zu der Inokulation der Mikrotiterplatten wird DNA aus den behandelten Bodenproben zur Darstellung der bakteriellen und eukaryotischen Bodenmikroflora isoliert. Der Versuchsansatz ist unter 3.1.2 beschrieben.

Weder die PEITC-, PPN- oder NaSCN-Konzentration in den Kavernen noch die Vorbehandlung der Bodenproben hat einen Einfluss auf die bei 595 nm gemessene Extinktion der Kulturen in der Kavernen nach zehn Tagen Kultur. Die Reduktion von Triphenyltetrazoliumchlorid durch atmende Bakterien ist also in allen Kavernen ähnlich. Bei der Betrachtung mit bloßem Auge fällt allerdings farblicher Unterschied zwischen den in den Kavernen wachsenden Kulturen auf: Nach einer Vorbehandlung des Bodens mit PEITC oder PPN sind die Kulturen in 22 ± 1 von 23 Kavernen zitronengelb, bei einer Vorbehandlung mit NaSCN oder Wasser dagegen nur die Kulturen in 5 ± 3 Kavernen. Die zitronengelben Kulturen fluoreszieren unter UV-Licht von 365 nm (Abb. 3). Vermutlich handelt es sich hierbei um fluoreszierende Pseudomonaden.

4. Ergebnisse

Abbildung 3: Wachstum fluoreszierender Mikroorganismen in einer Mikrotiterplatte 10 Tage nach Beimpfung mit Bodenlösung aus mit PEITC, PPN, NaSCN (SCN) bzw. H2O vorbehandelten Boden. Aufnahme bei 365 nm UV-Licht. Für die DGGE wird DNA aus den mit einem Pfeil markierten Kavernen isoliert.

Die Vorbehandlung des Bodens mit PEITC, PPN, NaSCN oder Wasser hat nicht zu einer mit der DGGE detektierbaren Veränderung der Artenzusammensetzung der Bakterien im Boden geführt (Abb. 4). Die Bakterienpopulationen in der Kaverne mit der höchsten PEITC-Konzentration wird in der DGGE bei allen Bodenbehandlungsvarianten von einer starken Bande dominiert. Diese dominante Bande ist bei der Vorbehandlung mit PEITC und PPN stärker ausgeprägt als bei der Behandlung mit NaSCN. Dabei ist die dominante Bande bei den mit PEITC, PPN oder NaSCN vorbehandelten Proben im Boden selbst nicht nachzuweisen.

Nach Inokulation der Kaverne mit der höchsten PEITC-Konzentration mit Bodensupension des mit Wasser behandelten Kontrollbodens ist dagegen eine andere Bande dominant. Diese Bande ist auch in den Kavernen mit PEITC, PPN oder NaSCN vorbehandelten Proben und im Boden nachzuweisen.

Auch im DGGE-Bandenmuster der eukaryotischen Bodenmikroflora wird kein Effekt der Wiederbefeuchtung des Bodens mit PEITC-, PPN- oder NaSCN-Lösung bzw. Wasser erkennbar. Die Artenzusammensetzung an eukaryotischen Mikroorganismen in den Kavernen mit der jeweils höchsten PEITC-Konzentration unterscheidet sich deutlich von dem im Boden gefundenen Artenspektrum. Die Bodenbehandlung mit PEITC und PPN führt zu einem weitgehend identischen Bandenmuster der aus den in den Kavernen gewachsenen Mikroorganismen isolierten DNA, das sich von dem mit NaSCN oder Wasser vorbehandelten Proben deutlich unterscheidet.

PEITC PPN SCN H2O

Kaverne mit starker

Fluoreszenz Kaverne mit schwacher

Fluoreszenz Legende:

Abbildung 4: Vergleich der DGGE-Bandenmuster bakterieller direkt aus dem Boden oder nach zehntägiger Kultur in Mikrotiterplatten isolierten DNA. Der Boden wurde fünf Tage vor DNA-Isolierung mit wässriger PEITC-, PPN-, NaSCN- (SCN) -Lösung bzw. mit Wasser wiederbefeuchtet.

Die 10^-2 Verdünnung der Bodenlösung derselben Bodenproben wurde zur Beimpfung der Mikrotiterplatten genutzt. Die mit ‚a‘ gekennzeichnete Bande stammt von Bakterien, die dominant in den mit PEITC-, PPN-, NaSCN - (SCN) -Lösung behandelten Proben beimpften Kavernen sind, und die im Boden zu selten sind, um als Bande dargestellt zu werden. Die mit ‚b’ gekennzeichnete Bande ist die dominante Bande in der nur mit Wasser wiederbefeuchteten Probe beimpften Kaverne und stammt von Bakterien, die auch im Boden häufig waren.

Der Einfluss von PEITC und PPN auf die Bodenmikroflora, der sich mit den Mikrotiterplatten nachweisen lässt, wird bei der DGGE der direkt aus dem Boden isolierten DNA nicht erkennbar. Hierbei entspricht die Artenzusammensetzung der in den Kavernen kultivierten Organismen nicht der, die sich in der Ausgangsbodenproben nachweisen lässt. Die Art, die von PEITC und PPN profitiert hat und in den Kavernen die dominante Bande gebildet hat, ist im Boden zu selten gewesen, um im Bandenmuster der Bodenproben zu erscheinen. Da der trockene Boden erst mit den PEITC-, PPN- und NaSCN-Lösungen wiederbefeuchtet worden ist, ist es möglich, dass ein Großteil der mit der DGGE dargestellten Banden von Dauerstadien stammt. Das könnte erklären, weshalb die unterschiedlichen Behandlungen keine Unterschiede im Bandenmuster der direkt aus dem Boden isolierten DNA zeigten.

Das Wachstum der Bodenmikroorganismen in den Mikrotiterplatten ist unabhängig von der angebotenen PEITC-, PPN- oder NaSCN-Konzentration in allen Kavernen ähnlich. Versuch 4.1.1. zeigt, dass Bodenmikroorganismen PEITC schnell abbauen können. Möglicherweise wird das PEITC, PPN und SCN^- in den Kavernen so schnell abgebaut, dass anschließend die

Standard Standard

DNA aus Kultur DNA aus Boden

H20 SCN PPN PEITC H20 SCN PPN PEITC H20 SCN PPN PEITC H20 SCN PPN PEITC

a

b b

4. Ergebnisse Bodenmikroorganismen in allen Kavernen unter gleichen Bedingungen wachsen können. Der Ansatz die PEITC-, PPN- oder SCN^--Toleranz einer Mikroorganismengesellschaft mit einem einfachen Test nachzuweisen, ist daher gescheitert. Allerdings zeigt ein Nebeneffekt, nämlich die verstärkte Entwicklung von –vermutlich- fluoreszierenden Pseudomonaden in den Mikrotiterplatten, dass PEITC und PPN die Artenzusammensetzung der Bodenmikroflora beeinflussen können.

In diesem Versuch hat PPN eine vergleichbare Wirkung auf die Bodenmikroflora, wie PEITC. Allerdings kann PPN in den unter 4.2 - 4.4 beschriebenen Versuchen in der Rhizosphäre der untersuchten Rapssorten nicht nachgewiesen werden. Daher wird im folgenden auf PPN nicht weiter eingegangen.