Validierung der MRM-Methode

Die MRM-Methode wurde für die relative Quantifizierung der mit der EMS-Methode ermittelten sekundären phenolischen Metabolite entwickelt. Die Validierung dieser quantitativen Methode umfasste die Parameter Methodenpräzision, biologische Variabilität, Nachweisgrenze (NG) und Bestimmungsgrenze (BG) sowie die Kalibrierfunktion. Diese Parameter wurden für jeden einzelnen in der MRM-Methode zu bestimmenden phenolischen Sekundärmetaboliten ermittelt.

Wird bei einem biologischen Experiment von jeder Pflanze jeweils nur ein Blatt geerntet und werden die erhaltenen Einzelblätter anschließend getrennt voneinander untersucht, so handelt es sich bei den Einzelblättern um biologisch unabhängige Proben. Auch für die relative Quantifizierung der zu bestimmenden phenolischen Sekundärmetabolite wurden durch die Ernte von je einem einzelnen Blatt pro Pflanze für die Ozonbehandlung mit einer Ernte nach 10 h sowie 30 h jeweils acht bzw. sieben biologisch unabhängige Proben geerntet. Außerdem wurden bei jedem Experiment zeitgleich jeweils acht unabhängige Proben von acht Kontrollpflanzen genommen. Zur Untersuchung der biologischen Variabilität wurden von den Einzelblattproben der 30 h Ozon-Werte je zwei Extrakte hergestellt und die resultierenden Peakflächen für den jeweiligen Metaboliten mit der MRM-Methode bestimmt. Die ermittelten Peakflächen wurden dann auf eine Einwaage von 200 mg Frischgewicht normiert und anschließend der Mittelwert sowie der VK für den jeweiligen Metaboliten berechnet. Der gemittelte VK der Doppelbestimmungen aller Einzelblattproben eines bestimmten Metaboliten spiegelt die Methodenpräzision dieses Metaboliten wider. Die methodischen VKs der einzelnen Metabolite sind in Tab. 3.9 aufgeführt. Für die gemittelte Methodenpräzision aller Metabolite der MRM-Methode wurde ein methodischer Gesamt-VK von 3,2 % ± 1,5 % berechnet. Dabei ist zu erkennen, dass der methodische Gesamt-VK von dem jeweiligen

betrachteten Metaboliten abhängt. Dies könnte unter anderem darauf zurückzuführen sein, dass die zu bestimmenden Metabolite unterschiedlich große Peakflächen aufwiesen.

Substanzen mit größeren Peakflächen wiesen in der Regel geringere VKs auf als Substanzen mit kleineren Peakflächen. Eine weitere Rolle könnte eine unterschiedliche Reproduzierbarkeit der Ausbeute der einzelnen Metabolite während der Extraktion spielen.

Für die Bestimmung der biologischen Variabilität wurde aus den acht Mittelwerten der Doppelbestimmung der biologisch unabhängigen Einzelblattproben die biologische Variabilität jedes einzelnen Metaboliten ermittelt. Die in Tab. 3.9 aufgeführten biologischen VKs spiegeln die biologische Variabilität der Einzelblattproben wider. Für die gemittelte biologische Variabilität aller Metabolite für die MRM-Methode wurde ein biologischer Gesamt-VK von 30,1 % ± 13,4 % berechnet. Die biologische Variabilität ist folglich viel größer als die Variabilität der Gesamtmethode. Dies ist auch zu erwarten (Dunn et al. 2005) und ermöglicht eine relative Quantifizierung. Wie bei der Methodenpräzision ist auch bei der biologischen Variabilität die Größe der VKs bei den jeweiligen zu bestimmenden Metaboliten variabel. Zu einem ähnlichen Wert bei einer anderen Metabolite Profiling Studie mit LC-ESI-MS kamen auch von Roepenack-Lahaye et al. (2004). Hier wurde für zu ermittelnde Sekundärmetabolite aus Blättern von A. thaliana eine gemittelte biologische Variabilität von 35,5 % ± 14,0 % bestimmt.

Zusätzlich zu den methodischen und biologischen VKs der MRM-Methode der einzelnen Metabolite wurden die NG und BG sowie die Linearität der MRM-Methode für alle zu bestimmenden Metabolite bis zu einer Verdünnung von 1:100 ermittelt. Für die Ermittlung dieser drei Parameter in der MRM-Methode war es erforderlich mit den Extrakten von Pflanzenproben zu arbeiten, um den Einfluss der Matrix auf die entwickelte Methode bei der Validierung zu berücksichtigen, da ansonsten nur die Linearität der LC-ESI-MS/MS-Messung bestimmt werden würde. Eine Bestimmung der Parameter erfolgte daher durch die stetige Verdünnung von zwei Extrakten einer ozonexponierten Poolprobe (30 h) bis zu einer Verdünnung von 1:100 und einer anschließenden Messung dieser Proben mit der MRM-Methode. Für die Ermittlung der NG, der BG und der Linearität der Methode wurde eine ozonexponierte Probe (30 h) verwendet, da diese alle Metaboliten, bis auf SA, in höheren oder vergleichbaren Konzentrationen im Vergleich zu einer ozonexponierten Probe (10 h) enthält. Dadurch wurde der größtmögliche Konzentrationsbereich der Kalibriergerade

erhalten, bei dem eine Bestimmung der Linearität der Methode, unter Berücksichtigung der Matrix, durchgeführt werden konnte.

Bei der NG wird die kleinste nachweisbare Menge und bei der BG die kleinste quantifizierbare Menge einer Substanz bestimmt. Eine übliche Vorgehensweise bei der Ermittlung der NG und BG ist die Abschätzung aus der Peakhöhe im Chromatogramm (Kromidas 2000). Durch eine stetige Verdünnung der zwei Extrakte einer ozonexponierten Probe (30 h) bis zu einer Verdünnung von 1:100 wurde ermittelt, bis zu welcher Verdünnung noch ein Signal für den jeweiligen Metaboliten zu erkennen ist. Hierbei wurde für die Ermittlung der NG ein S/N-Verhältnis von 3:1 und für die BG von 9:1 zugrunde gelegt (Kromidas 2000). Die ermittelten NG und BG wurden bis zu einer Verdünnung von 1:100 ermittelt und sind in Tab. 3.9 angegeben.

Neben der Bestimmung der NG und BG wurde außerdem überprüft, über welchen Konzentrationsbereich eine Linearität der Analysenmethode für den jeweiligen Metaboliten gegeben ist. Hierfür wurden verschiedene Verdünnungen von zwei unabhängigen ozonexponierten Proben (30 h) bis zu einer Verdünnung von 1:100 mit der MRM-Methode gemessen und die für den jeweiligen Metaboliten erhaltenen Werte der Peakfläche gemittelt.

Anschließend wurde geprüft, in welchem Konzentrationsbereich ein linearer funktionaler Zusammenhang zwischen den gemittelten Peakflächen und den durchgeführten Verdünnungen bestand, indem eine Kalibrierfunktion ermittelt wurde. Für die Bestimmung wurde das Verfahren der linearen Regression nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate durchgeführt. Ein wichtiges Kriterium für die Linearität einer Methode ist der Korrelationskoeffizient r. Der Korrelationskoeffizient r ist ein Maß für den Grad der Anpassung eines mathematischen Modells an die experimentell ermittelten Werte und sollte möglichst einen Absolutbetrag von 0,999 aufweisen (Kromidas 2000). Für die Detektion mit der MRM-Methode ergab sich für fast alle zu bestimmenden Metabolite bis zu einer Verdünnung von 1:100 bzw. 1:80 und 1:70 ein linearer Zusammenhang mit Korrelationskoeffizienten von r=0,9885-0,9994. Für die Metaboliten mit den quasimolekularen Massen m/z 137,1 und m/z 485,2, die bereits in der unverdünnten Probe sehr kleine Peakflächen aufwiesen, bestand ein linearer Zusammenhang zwischen der Verdünnungsstufe und der Peakfläche bis zu einer Verdünnung von 1:20. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.9 dargestellt.

TABELLE 3.9: Validierungsparameter der MRM-Methode

RT (min)

Übergang (amu)

Methodischer VK (%)

Biologischer VK (%)

NG

(Verdünnungs-stufe)

BG

(Verdünnungs-stufe)

Linearität gegeben bis Verdünnung von

8,0 353,1/191,1 3,6 35,5 > 1:100 > 1:100 1:100 9,6 353,1/191,1 3,5 22,8 > 1:100 > 1:100 1:100 9,9 343,1/181,1 3,3 28,3 1:100 1:80 1:80 10,9 299,1/137,1 2,3 21,4 > 1:100 > 1:100 1:100 11,1 477,2/431,2 2,1 20,9 > 1:100 1:100 1:100 11,4 353,1/191,1 1,1 26,3 > 1:100 > 1:100 1:100 12,0 343,1/181,1 3,5 20,0 1:100 1:80 1:80 12,8 447,2/401,2 1,8 28,4 > 1:100 1:100 1:100 13,0 353,1/191,1 2,0 14,6 > 1:100 > 1:100 1:100 13,6 353,1/191,1 3,1 11,1 > 1:100 > 1:100 1:100 13,8 469,2/423,2 2,5 39,4 > 1:100 1:100 1:100 14,1 337,1/173,1 4,6 10,8 > 1:100 1:100 1:100 14,4 353,1/191,1 1,1 19,7 > 1:100 > 1:100 1:100 15,2 337,1/173,1 1,1 18,4 > 1:100 1:100 1:100 15,3 439,2/393,2 2,2 38,6 1:100 1:70 1:70 16,2 439,2/393,2 2,0 21,4 1:100 1:80 1:80 16,1 337,1/191,1 5,6 27,3 > 1:100 1:100 1:100 16,5 337,1/191,1 3,6 20,4 > 1:100 1:100 1:100 16,7 367,1/191,1 3,1 17,9 > 1:100 1:100 1:100 17,1 367,1/191,1 3,0 19,5 > 1:100 1:100 1:100 17,6 312,1/178,2 5,3 36,1 > 1:100 > 1:100 1:100 18,8 312,1/178,2 3,2 41,7 1:100 1:80 1:80 19,2 319,1/163,1 4,6 56,7 > 1:100 1:100 1:100 19,3 319,1/163,1 6,1 35,6 > 1:100 1:100 1:100 20,5 137,1/93,0 1,5 46,7 1:70 1:20 1:20 20,7 515,1/191,1 3,2 40,6 > 1:100 > 1:100 1:100

22,3 312,1/178,2 2,2 48,0 > 1:100 > 1:100 1:100 24,0 312,1/178,2 3,9 45,4 > 1:100 > 1:100 1:100 24,0 805,6/773,4 3,2 38,0 > 1:100 > 1:100 1:100 25,0 805,6/773,4 3,2 28,2 > 1:100 > 1:100 1:100 26,8 151,1/107,0 2,7 8,8 > 1:100 > 1:100 1:100

26,8 485,2/397,2 8,6 37,2 1:50 1:20 1:20 27,8 437,2/377,2 2,3 66,0 > 1:100 1:100 1:100 Variationskoeffizient (VK). Nachweisgrenze (NG). Bestimmungsgrenze (BG).

3.5 Optimierung der substanzspezifischen Fragmentierungsparameter