Ustilago maydis

in ddH2O pH5,8 mit NaOH einstellen

sterilfiltrieren

4.2.2 Ustilago maydis

Kultivierung

Für die Kultivierung von U. maydis wurden folgende Medien verwendet:

Ammonium-Minimalmedium (AM) (Holliday, 1974)

3 g (NH4)2SO4 62,5 ml Salz-Lösung ad 980ml ddH20

pH7,0 mit NaOH einstellen autoklavieren nach dem Autoklavieren:

1 % (f.c.) Glucose-Lösung

Nitrat-Minimalmedium (NM) (Holliday, 1974)

3 g KNO3 62,5 ml Salz-Lösung ad 980ml ddH20

pH7,0 mit NaOH einstellen autoklavieren nach dem Autoklavieren:

1 % Glucose-Lösung (f.c.)

CM-Vollmedium

(Holliday, 1974; Banuett und Herskowitz, 1989) 1,5 g NH4NO3

2,5 g Casaminosäuren 0,5 g DNA

1 g Hefeextrakt 10ml Vitamin-Lösung 62,5 ml Salz-Lösung ad 980ml ddH2O

pH7,0 mit NaOH einstellen autoklavieren nach dem Autoklavieren:

1 % Glucose-Lösung (f.c.)

Salz-Lösung (Holliday, 1974)

16 g KH2PO4 4 g NaSO4 8 g KCl

4 g MgSO4·^{7 H}2O 1,32 g CaCl2·^{2 H}2O

8 ml Spurenelement-Lösung ad 1 l ddH₂O

sterilfiltrieren

Vitamin-Lösung (Holliday, 1974)

100mg Thiamin 50mg Riboflavin 50mg Pyridoxin 200mg Calciumpantothenat 500mg p--Aminobenzoesäure 200mg Nikotinsäure 200mg Cholinchlorid 1000mg Myo-Inositol

ad 1 l ddH₂O sterilfiltrieren

Spurenelement-Lösung (Holliday, 1974)

60mg H₃BO₃ 140mg MnCl₂·^{4 H}2O 400mg ZnCl₂ 400mg NaMoO₄·^{2 H}2O 100mg FeCl₃·^{6 H}2O 400mg CuSO₄·^{5 H}2O

ad 1 l ddH₂O sterilfiltrieren

PD-Medium

24 g Potato Dextrose Broth ad 1 l ddH₂O

Aktivkohlehaltiges PD-Medium (PD-CC) 24 g Potato Dextrose Broth 10 g Aktivkohle

20 g Bacto-Agar ad 1 l ddH₂O

YEPS_light-Medium

modifiziert nach Tsukuda et al. (1988):

10 g Yeast Extract 10 g Pepton 10 g Saccharose ad 1 l ddH₂O

4.2 Mikrobiologische, genetische und zellbiologische Methoden 94

Für Festmedien wurde Bacto-Agar in einer Endkon-zentration von 2 % zugegeben. Medienzusätze wurden, soweit nicht anders vermerkt, in folgenden Konzentra-tionen eingesetzt: Carboxin (2 µg·ml^-1), CloNAT (150µg·ml^-1), Hygromycin (200µg·ml^-1) und Phleomy-cin (40µg·ml^-1). Im Fall der Selektion mit Phleomycin musste zusätzlich TRIS-Cl pH8,0 in einer Endkonzen-tration von 100mM zugesetzt werden, da sonst das Antibiotikum wegen der Ansäuerung des Mediums durch U. maydis inaktiviert wird.

Bestimmung der Zelldichte

Die Zelldichte von Flüssigkulturen wurde photome-trisch in einem Novospec II Photometer (Pharmacia Biotech) bei 600nm bestimmt. Um eine lineare Abhän-gigkeit sicherzustellen, wurden für die Messung der OD₆₀₀ die Kulturen durch entsprechende Verdünnung auf einen Wert unterhalb von 0,8 verdünnt. Als Null-wert wurde die OD₆₀₀ des jeweiligen Kulturmediums verwendet. OD₆₀₀= 1,0 entspricht etwa 1-5·10⁷Zellen·ml^-1.

Induktion des regulierbaren nar1 Promotors

Die Stämme wurden aus Vorkulturen in Flüssigme-dium angeimpft das reprimierende Bedingungen bot (NH₄⁺ als einzige Stickstoffquelle (AM- oder CM-Medium)) und bis zu OD₆₀₀= 0,5 bei 28 °C und 200Upm inkubiert. Die Zellen wurden in PP-Röhrchen überführt, abzentrifugiert (3000Upm, 5 min, RT, Bio-fuge Stratos). Anschließend wurden die Zellen im glei-chen Volumen frisglei-chen Mediums mit den induzierenden Bedingungen resuspendiert, in Schikan-ekolben überführt und für die gewünschte Zeit bei 28 °C inkubiert. Induzierende Bedingungen sind NO₃⁻ als einzige Stickstoffquelle.

Transformation

Dieses Protokoll ist modifiziert nach Schulz et al.

(1990) und Gillissen et al. (1992). Von einer auf Platte wachsenden Kultur wurde eine 4 ml YEPS_light -Flüssig-kultur angesetzt und für 8-10 h bei 28 °C geschüttelt.

Diese Vorkultur wurde anschließend 1:400 in 50 ml fri-schem YEPS_light-Medium verdünnt und bei 28 °C bis zu einer Zelldichte von 1-2·10⁷Zellen·ml^-1 (bis maxi-mal OD₆₀₀= 0,9) geschüttelt. Nach Erreichen des optimalen Zelltiters wurden die Zellen durch Zentrifu-gieren (3500Upm, 5 min, RT, Heraeus Varifuge 3.0R) geerntet, einmal mit 25ml SCS gewaschen und in 2 ml SCS mit 2,5 mg·ml^-1 Novozym resuspendiert. Die in diesem Puffer bei Raumtemperatur ablaufende Proto-plastierung kann mikroskopisch verfolgt werden, da die zigarrenförmigen Zellen nach Lyse der Zellwand eine kugelige Form einnehmen. Nach vollständiger Proto-plastierung (5-15min) wurden 10ml eiskaltes SCS zuge-geben und die Protoplasten durch fünfminütiges Zentrifugieren bei 2400Upm (4 °C, Heraeus Varifuge 3.0R) pelletiert. Um das Novozym vollständig zu ent-fernen, wurde dieser Waschgang dreimal wiederholt.

Anschließend wurde mit 10ml eiskaltem STC gewa-schen und das Pellet danach in einem Volumen von 0,5 ml eiskaltem STC aufgenommen. Die so behandel-ten Protoplasbehandel-ten können 3-4 h auf Eis oder aliquotiert bei -80 °C mehrere Monate aufbewahrt werden.

Zur integrativen Transformation wurden 50µl Proto-plasten mit 1-5 µl linearisierter Plasmid-DNA (ca. 5 µg) und 1 µl Heparin-Lösung für 10min auf Eis inkubiert.

Nach Zugabe von 0,5 ml STC/PEG folgte eine weitere Inkubation von 15min auf Eis. Anschließend wurde der gesamte Transformationsansatz auf einer kurz zuvor mit Top-Agar überschichteten Regenerationsa-garplatte ausgestrichen. Nach zwei bis fünf Tagen Inkubation bei 28 °C wurden die gewachsenen Kolo-nien mit sterilen Zahnstochern auf

antibiotikumhalti-4.2.2 Ustilago maydis 95

gen CM-Platten, vereinzelt. Potenzielle Transformanten wurden mittels Ganzzell-PCR vorse-lektiert und abschließend durch Southern-Analyse veri-fiziert

SCS

20mM Na-Citrat (pH5,8) 1 M Sorbitol

in ddH2O sterilfiltrieren

STC

10mM Tris-Cl (pH7,5) 100mM CaCl2

1 M Sorbitol in ddH2O sterilfiltrieren

STC/PEG 15ml STC

10 g PEG4000

Regenerationsagar (Schulz et al., 1990) a) Top-Agar

1,5 % Bacto-Agar (w/v) 1 M Sorbitol

0,4 % Saccharose (w/v) 0,4 % Pepton (w/v)

1 % Hefe-Extrakt (w/v) in ddH2O b) Bottom-Agar

wie a), zusätzlich doppelt konzentriertes Antibiotikum

Herstellung der Deletionsstämme

Die Stämme wurden mit Hilfe eines PCR-gestützten Methode erzeugt (Brachmann et al., 2004; Kämper, 2004). Dafür wurden für jedes Deletionskonstrukt acht Oligonukleotide entworfen: u1, u2 und u3 (für die stromaufwärtsgelegene flankierende Sequenz), d1, d2 und d3 (für die stromabwärtsgelegene flankierende Sequenz) sowie p1 und p2 (für diagnostische Zwecke) (Brachmann et al., 2004) (siehe Abb. 4-1, Tabelle 4-5 und Tabelle 4-1). Mit den Oligonukleotiden u2 und u3 bzw. d1 und d2 werden die flankierenden Bereiche (~1 kb) der zu deletierenden Region mit der genomi-schen Matrizen-DNA des Stamms 521 amplifiziert (Abb. 4-1 Spur 1 und 2). u3 bzw. d1 führen die SfiI_(u) bzw. SfiI_(d) Restriktionsschnittstelle am 3’- bzw.

)%

)%

$UUP

)%

)%

$UUP

)%

)%

$UUP

SS XKX KGG

80

XX

80

GG

S80D

XG

3ULPHU

'1$

%

$

*HQYRQ,QWHUHVVH aNE X

X G G

>K\J⁵@

X KX KG G

aNE

X G

aNE ABB. 4-1 Strategie zum Erzeugen von Gen-deletionsmutanten

(A) Schematische Darstellung eines Lokus, mit dem Gen von Interesse vor (oben) und nach (unten) der homologen Rekombination der Hy-gromycin-Resistenzkassette ([hyg^R]). Die be-schrifteten Pfeile geben Position und Typ der verwendeten Oligonukleotide an. Die Positio-nen der stromaufwärts (in ’u3’) bzw. stromab-wärts (in ’d1’) SfiI Schnittstellen sind als rote Linien dargestellt. (B) Die Bestätigung der ho-mologen Rekombinationen fand mittels diagno-stischer PCR statt, gezeigt am Beispiel der Stämme FB1∆rrm4 #1 und #2. Die Kombinatio-nen der Oligonukleotide und der Matrizen-DNA sind über dem Bild angegeben. ’u1’ und ’d3’ lie-gen außerhalb des rekombinierten Bereichs.

Die PCR-Produkte wurden über ein 1,5%iges Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbro-mid gefärbt. Die Größenmarkierungen sind links in Kilobasen angegeben.

4.2 Mikrobiologische, genetische und zellbiologische Methoden 96

5’-Ende des PCR-Produkts ein. Die amplifizierten Fragmente wurden mit SfiI verdaut und in Anwesen-heit eines ~1,8 kb großen SfiI_(u)/SfiI_(d) [hyg^R ]-Frag-ments ligiert (Kämper, 2004). Die gelgereinigten Ligationsprodukte wurden in den Vektor pCR^®2.1-TOPO^® kloniert. Die erhaltenen Plasmide wurden als Matrize zur PCR-Amplifikation mit den Oligonukleotiden u2 und d2 verwendet (Abb. 4-1 Spur 3) und das Produkt anschließend in die Wildtypstämme FB1 und FB2 transformiert. Die hygromycinresisten-ten Kolonien wurden in einer Ganz-Zell-PCR mit den Oligonukleotiden p1 und p2 untersucht. Die Amplifi-kation eines ~200bp großen Produkts zeigte die Anwe-senheit des Wildtyp Allels an und deutete auf eine nicht homologe Integration der [hyg^R] hin. Konnte das dia-gnostische PCR-Produkt nicht amplifiziert werden (Abb. 4-1 Spur 5 und 6), wurden die Stämme weiter untersucht: Die homologe Rekombination des Deleti-onskonstrukts wurde durch die Amplifikation des stromabwärts- und des stromaufwärtsflankierenden Bereichs verifiziert. Dabei wurden die Oligonukleotide u1 und d3, die außerhalb des deletierten Bereichs lie-gen, sowie hu und hd, die in der [hyg^R] liegen, verwen-det. Mit u1 und hu bzw. hd und d3 lassen sich bei erfolgreicher homologer Deletion zwei ~1 kb große Produkte amplifizieren (Abb. 4-1 Spur 7-9 bzw. Spur 10-12).

Wachstumstest auf CM- und NM-Platten Die zu testenden Stämme wurden übernacht bei 28 °C auf einem Schüttler (200Upm) in CM-Glucose bis zu einer OD₆₀₀= 0,8 angezogen. Mit einer Neu-bauer-Zählkammer wurde die Zelldichte bestimmt. Ein Aliquot wurde pelletiert (3500Upm, RT, 5 min) und die Zelldichte auf 10⁶Zellen·ml^-1 mit ddH₂0 eingestellt.

2 µl der schrittweise 1:5-verdünnten Zellsuspension wurden auf CM- bzw. NM-Platten getropft und für

zwei bis fünf Tage bei 15, 28 und 34 °C inkubiert. Die Koloniepigmentierung, -morphologie und das Kolo-niewachstum wurde visuell analysiert.

Quantifizierung der Antwort auf externes cAMP

Es wurden 1 ml der zu testenden Stämme übernacht in einem 2 ml Reaktionsgefäß (verschlossen mit Lid_Bac (Eppendorf)) bei 28 °C in CM-Vollmedium auf einem Thermomixer compact (Eppendorf) bei 1100Upm angezogen. Es wurden jeweils 2 µl der Zellsuspension (stationäre Phase) in 1 ml 15mM cAMP-enthaltendes bzw. 1 ml cAMP-freies CM-Medium überimpft und für 18 Stunden bei 28 °C auf einem Thermomixer compact (Eppendorf) bei 1100Upm inkubiert. Die prozentuale Häufigkeit der Zellaggregate mit mehr als zwei Zellen wurde dann mit einer Neubauer Zählkammer bestimmt.

Pheromonstimulation in Flüssigkultur Die zu testenden Stämme wurden in CM-Flüssigme-dium bis zu einer OD₆₀₀= 0,8 angezogen. Jeweils 500µl Kultur wurde in ein Eppendorf-Gefäß überführt und kompatibles Pheromon in DMSO in einer End-konzentration von 1 µg·ml^-1 oder nur DMSO zuge-ben. Wenn nicht anders beschrieben wurden die Ansätze bei 20 °C auf einem Drehrad oder horizontal schüttelnd bei 200Upm für 6-8 h inkubiert.

Konfrontationstest

Diese Methode ist in Snetselaar et al. (1996) näher beschrieben. Die zu testenden Stämme wurden bei 20 °C bzw. 28 °C mit 200Upm bis zu einer OD₆₀₀= 0,8 angezogen. Die Zellen wurden pelletiert (Heraeus Biofuge) und bis zu einer OD₆₀₀= 5 in ddH₂O resuspendiert. Objektträger wurden mit 2%igem Wasseragar in einer Höhe von ca. 2 mm

Im Dokument Die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der pathogenen Entwicklung von Ustilago maydis (Seite 109-113)