Untersuchungen an Oligonukleotiden

An Nukleosiden konnte belegt werden (s. Abs. 2.9.1), dass es entscheidend ist, dass sich der lipophile Rest am Zucker befindet, damit membranverankerte Nukleolipide für eine Basenpaarung zur Verfügung stehen können.

Doch wie ist es mit Oligonukleotiden? Ist es dort auch entscheidend, an welcher Stelle der lipophile Anker hängt? Dazu einige grundlegende Aspekte. Zum einen haben wir von der Natur gelernt, dass viele membrange-bundene Proteine zwei lipophile Anker für eine stabile Verankerung tragen. Weiterhin konnte an einigen Beispie-len im Kapitel 1 gezeigt werden, dass Oligonukleotide für eine stabile Membranverankerung auch zwei lipophile Ketten tragen sollten. Diese Beobachtungen wurde bei der Wahl der Oligonukleotidsequenzen in den meisten Fällen Rechnung getragen, durch den Einbau zwei lipophiler Nukleotide. Des Weiteren zeigten bisherige Arbei-ten aus unseren Arbeitskreis (Bunge et al., 2007; Kurz et al., 2006), dass Nukleotide, welche den Anker an der Nukleobase tragen, bei der Doppelstrangbildung nicht für eine Watson-Crick-Basenpaarung zur Verfügung ste-hen. Wahrscheinlich werden diese Nukleobasen zu weit in die Membran hineingezogen (s. Abb. 97). Es konnte nun erwartet werden, dass sich diese Situation ändert, wenn der Lipidanker am Zucker befestigt ist (s. Abb. 98).

Abbildung 97: Schematische Darstellung eines Oligonukleotides 5´-ULUU-UUU-UUUL-UUU-U-3´, wobei L der Anker an der 5-Position des Uridins ist.

Abbildung 98: Schematische Darstellung eines Oligonukleotides 5´-ULUU-UUU-UUUL-UUU-U-3´, wobei L den Anker an der 2´-Position des Uridins ist

Das 2´-lipidierte Nukleosid 70b wurde in eine analoge Oligonukleotidsequenz 5´-ULTT-TTT-TTUL -TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3´ (Oligo1b) eingebaut, wie sie auch bei den vorherigen Untersuchungen mit basenständigen Lipidanker (Flasche, 2005) verwendet wurde. Dabei ist L der lipophilen Anker an der 2´-Position des Uridins.

Für NMR-Messungen wurde zusätzlich ein Oligonukleotid Oligo2b synthetisiert, das anstelle des Hexadecylthi-oether die perdeuterierte Kette trägt.

Abbildung 99: Monomer UL des untersuchten Oligonukleotides

Wie auch bei den Nukleosiden zeigten die ³¹P–Pulverspektren (s. Abb. 100), dass Oligonukleotide den Phasenzu-stand der Membran nicht stören, d.h. auch hier erhält man ein Spektrum, was für eine lamellare flüssig-kristallinen Phase der Membran spricht. Da im Gegensatz zu den Nukleolipiden durch das Phosphatrückgrat des Oligonukleotides weitere ³¹P einen Einfluss auf das Spektrum geben, sieht man einen zusätzlichen isotropen Peak. Dieser schmale Peak spricht für eine hohe Beweglichkeit des Phosphatrückgrates.

Abbildung 100: ³¹P-NMR-Spektrum von POPC Membranen in Gegenwart des lipophilen Oligonukleotid Oligo1b bei einem Wassergehalt von 65 wt% (303 K). Die isotrope Linie wurde grau hinterlegt

Δσ /ppm SAV 〈L C • 〉 / Å

POPC(-d31) + 5 mol% DOTAP

47,2 0,158 11,61

POPC/Oligo1b + 5 mol% DOTAP

44,3 0,154 11,50

POPC(-d31) 45,2 0,154 11,48

Abbildung 101: Geglättete ²H-NMR-Ordnungsparameterprofile der Proben POPC-d31 ( ), Oligo7/POPC-d31

( ), Oligo8/POPC-d31 (4), POPC-d31 + 5 mol% DOTAP (O) und Oligo1b/POPC-d31 + 5 mol% DOTAP (Ι) bei einem eingesetzten molaren Verhältnis POPC/Oligonukleotid 100/1 (für Oligo1b 200/1), Wassergehalt von 65

wt%, 303 K

Zur Bestimmung der Ordnungsparamter des Phospholipidmembran wurden ²H–Spektren aufgenommen (s. Abb.

101). An diesen erkennt man, dass die verankerten Oligonukleotide die Ordnung der Membran kaum stören, was für eine gute Inkorporierung spricht. Dabei sind die Oligonukleotide Oligo7 und Oligo8 jene, welche den li-pophilen Rest als Tocopherol an der 5-Position der Base tragen (Flasche, 2005) und das Oligonukleotid Oligo1b dasjenige, mit dem 2´-lipidierten Nukleosid 70b.

Die Darstellung des ²H-Spektren, aus denen die obengenannten Daten gewonnen wurden, zeigen sehr deutlich den großen isotropen Peak bei der Messung des Oligonukleotides Oligo2b mit dem deuterierten lipophilen Rest (s. Abb. 102 A), was wie oben schon erwähnt, für eine gute Beweglichkeit des Oligonukleotides spricht und demzufolge für eine schlechte Insertierung in die Membran. Die Verankerung ist demnach für diesen Fall schlechter, als bei der Verwendung von Oligonukleotiden mit einem Tocopherolanker an der 5-Position der Base, weswegen auch erst eine Zugabe von 5 mol% DOTAP (ein positiv geladenes Lipid) eine erfolgreiche Insertie-rung ermöglicht (s. Abb. 102 B). Durch ²H-NMR Spin-Gitter-Relaxationsmessungen konnte bei den Oligonukle-otiden keine Störung der Membranelastizität festgestellt werden.

Abbildung 102: ²H-NMR-Spektren der Proben (A) Oligo2b-d66/POPC, (B) Oligo1b/POPC-d31 + 5 mol%

DOTAP und (C) POPC-d31 + 5 mol% DOTAP bei einem Wassergehalt von 65 Gewichtsprozent. Die Spektren wurden bei 303 K aufgenommen. Die roten Linien sollen dem Leser bei der Bestimmung der Position der

Pla-teaupeaks helfen

Es konnte gezeigt werden, dass das Oligonukleotid Oligo1b in Membranen insertiert, wenn auch schlechter als die Oligonukleotide Oligo7 oder Oligo8 mit nukleobasenständigen Anker. Die Struktur der Phospholipid-membran wird dabei nicht gestört. Doch sind nun die erwartenden Basenpaarungen an den ankertragenden Nukleotiden möglich? Weiterhin ist zu klären, ob 2`-modifzierte Nukleoside die Duplexbildung der DNA stabili-sieren oder destabilistabili-sieren. Kottysch et al. (Kottysch et al., 2004) konnten zeigen, dass die Einführung von 5-modifzierten Uridin in einer DNA die Tm des Duplex über einen großen Bereich beeinflussen (+3.6 °C bei 10mM NaCl eines 12mer). Um diese Fragestellungen zu klären, bediente man sich der DSC–Messung (Duguid et al., 1996). Unter anderem fanden Letsinger et al. (Letsinger et al., 1993) bei der Bestimmung von Schmelz-temperaturen von Oligonukleotiden, dass durch die Anwesenheit von zwei hydrophoben Gruppen (Cholesterol) die hydrophoben Kräfte zwischen dem Cholesterol so stark sind, das ein polyA und ein polyT–Strang eine nor-malerweise instabile, parallele Orientierung aufweisen.

Für die im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit durchgeführten DSC–Messungen wurde zuerst eine Kalibrierungskurve durch Messungen der Schmelztemperaturen von 10T/10A-, 15T/15A-, 20T/20A- und 25T/25A-Duplexen ermittelt. Anschließend wurden die Schmelztemperaturen der lipophilen Oligonukleotide und ihre komplementären Partnern (A25) zum einen in Lösung und zum anderen membranassoziert gemessen.

Die Messung der Oligonukleotide Oligo8 und Oligo1 wurden bei höherer Salzkonzentration durchgeführt (150 mM KCl, statt 50 mM KCl, wie bei dem Oligonukleotid Oligo7 und dem unmodifizierten Oligonukleotid). Zum einen stellte es sich heraus, das die lipohilen Oligonukleotide in Lösung mehr Basenpaarungen eingehen, als in der Membran, nämlich statt 17 sind es 19 Basenpaare, was für eine Einbeziehung des lipophilen Nukleosides in Lösung spricht. Dem ist aber nicht so, wenn es membrangebunden ist. Zum anderen erkennt man eine um ~4 BP geringere Affinität gegenüber einem unmodifizierten Oligonukleotid Oligo10 mit der Sequenz 5´-CTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3´. Die beiden Cytidine in der Sequenz sollen eine Fehlpaarung simulie-ren. Diese verringerte Basenpaarung bestätigt den störenden Einfluss des lipophilen Ankers bei der

Doppel-strangbildung. Somit ist es gleich, wo sich der lipophile Anker am Nukleosid befindet, denn weder verbessert die Position im Nukleosid die Duplexbildung des Oligonukleotides noch findet eine Basenpaarung über das Nukleo-tid mit dem lipophilen Rest hinweg statt.

Oligonukleotid Schmelztemperatur TM /°C Anzahl Basenpaarungen n

Oligo7 (Membran) 39,5 17,5

Oligo8 (Membran) 44,4 15,8

Oligo1b (Membran) 47,2 17,4

Oligo1b (Lösung) 50.0 19,4

Oligo10 (Lösung) 46,1 22,9

Abbildung 103: Darstellung der für die molekulare Erkennung komplementärer Nukleinsäuren aktiven Be-reiche der membranassoziierten lipophilen Oligonukleotide. Der blaue Balken gibt den Teil der lipophilen

Oli-gonukleotide an, der mit komplementären Strängen eine Helix ausbilden kann