Untersuchung der putativen Rolle des Gene Silencings bei der Ausbildung von

Transgene P1/HC-Pro Maispflanzen wurden insgesamt achtmal selektiv im Gewächshaus mit der Inzuchtlinie A188 zurückgekreuzt, um einen nahezu vollständig homozygoten, transgenen Inzuchtlinien-Genotyp zu erzeugen. In jeder Generation wurden die Nachkommen, zum Erhalt der Transgene, mit Basta (300 mg/L) selektiert und nur transgene Pflanzen in der nächsten Phase der Introgression verwendet.

Ziel des Versuches war es den Einfluss des Gene Silencing Suppressors P1/HC-Pro und damit verbunden den Einfluss kurzer RNAs auf den Heterosis-Effekt zu untersuchen. Hierzu wurden die transgenen P1/HC-Pro Pflanzen reziprok mit H99 Inzuchtlinien und mit A188 Inzuchtlinien gekreuzt und nach einem Tag das Nucellus Gewebe in eine in vitro-Kultur zur Induktion des Transgens überführt. Die etablierte Gewebekultur erlaubte eine Kultivierung des intakten Embryosacks einen Tag nach Bestäubung unter kontrollierten Bedingungen bis zur Entwicklung eines intakten Keimlings (Campenot et al. 1992).

2.2.22..88..11 AAnnzzuucchhtt ddeerr MMaaiissppffllaannzzeenn iimm GGeewwääcchhsshhaauuss

Die transgenen P1/HC-Pro Maispflanzen, sowie die Inzuchtlinien H99 und A188 wurden im Gewächshaus in Töpfen unter Standardbedingungen angezogen. Die Bewässerung erfolgte automatisch und die Lichtstärke wurde durch eine Lichtanlage gesteuert, die sich bei einer maximalen Lichtsumme von 600 kLuxh/Tag abschaltete. Die Anlage war auf einen Tag/Nacht-Wechsel von 16 Stunden Helligkeit und 8 Stunden Dunkelheit eingestellt. Die tatsächliche Lichtsumme betrug im Winter ca. 230-250 kluxh/Tag und im Sommer ca. 400-600 kluxh/Tag. Die Kreuzungen der Maispflanzen verliefen unter streng kontrollierten Bedingungen. Zu diesem Zweck wurden die sich entwickelnden Kolben so früh wie möglich vor dem Austreten der Nebenfäden mit einer Papiertüte abgedeckt, um eine ungewollte Fremdbestäubung zu vermeiden. Die gezielten Kreuzungen fanden morgens zwischen 9 und 11 Uhr statt.

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2..22..88..22 IInn vviittrroo KKuullttuurr vvoonn NNuucceelllluuss GGeewweebbee eeiinneenn TTaagg nnaacchh ddeerr BBeessttääuubbuunngg

Nucellus Gewebe aus den reziproken Kreuzungen, zwischen den transgenen P1/HC-Pro-Pflanzen und A188 bzw. H99, wurde nach einem Protokoll von Campenot et al. (1992) einen Tag nach Bestäubung aus dem Korn isoliert und auf Platten mit einem modifizierten Muras-hige-Skook (MS) Medium aufgelegt. Dexamethason im modifizierten MS-Medium in einer Konzentration von 20 µM diente zur Induktion der Transgenexpression. Die Hälfte der Platten enthielt kein Dexamethason, um Effekte bedingt durch das Induktionsmedium ausschließen zu können. 2 Tage nach dem Auskeimen der Maisembyronen wurden diese von der Platte in ein Weckglas mit Standard-MS-Medium (mit bzw. ohne Dexamethason) (Murashige und Skoog 1962) überführt. Die Messung des Pflanzenwachstums erfolgte das erste Mal 6 Tage nach Überführung in das Weckglas und dann insgesamt achtmal alle 2 Tage.

Zur Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit wurde eine lineare Regression durchgeführt und durch die Messpunkte eine Gerade gelegt und das Bestimmtheitsmaß berechnet. Die Steigung der linearen Regression repräsentierte die Wachstumsgeschwindigkeit der Mais-pflanzen. Nur Wachstumsgeschwindigkeiten mit einem Bestimmtheitsmaß der linearen Regression von über 0,97 wurden in die Analyse mit einbezogen.

Anhand einer Gus-Färbung (Kapitel 2.2.8.3) wurde jede Pflanze, sowohl die induzierten als auch die nicht-induzierten, nach vorheriger Induktion des Blattmaterials auf die Expression des Transgens hin untersucht. Dies geschah zur Unterscheidung der tansgenen Nachkommen von den nicht-transgenen Nachkommen, da aufgrund der Hemizygotie des P1/HC-Pro-Konstruktes nur 50% der Nachkommen ebenfalls transgen waren.

Die Daten der reziproken Pflanzen eines jeden Genotyps wurden im weiteren Verlauf der Auswertung gemeinsam betrachtet. Für jeden Genotyp wurde die BPH (best parent heterosis) berechnet, also der Zuwachs der Hybride gegenüber den homozygoten Inzuchtlinien-Kreuzungen A188xA188.

Ein statistische Tests (T-Test, ANOVA) zwischen den Heterosis-Daten der transgenen und der nicht-transgenen, bzw. der induzierten und nicht-induzierten Genotypen sollte zeigen, ob ein signifikanter Unterschied zwischen Pflanzen, die den Gene Silencing Suppressor expri-mieren und denen ohne Suppressor, bezogen auf Heterosis bestand.

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2..22..88..33 ßß--GGlluuccuurroonniiddaassee ((GGuuss))--FFäärrbbuunngg

Zur Überprüfung der Expression der Transgene in den P1/HC-Pro -Pflanzen wurde Pflanzen-material, wie z.B. Blattgewebe oder Nucellus-Gewebe, in einer kleinen Petrischale mit X-Gluc-Lösung zur Gänze bedeckt. Um eine Färbung tieferliegender Zellschichten zu gewähr-leisten wurde beim Nucellus-Gewebe ein Vakuum für die Dauer einer Minute angelegt und dieser Schritt fünfmal wiederholt. Es folgte eine Inkubation bei 37°C über Nacht. Beim Blattgewebe wurde die X-Gluc-Lösung abgenommen und das Gewebe mit 70% Ethanol über Nacht inkubiert, um das Chlorophyll auszuwaschen. Bei einer erfolgreichen Gus-Expression konnte eine deutliche Blaufärbung des untersuchten Gewebes beobachtet werden.

Bei biologischem Material, welches nicht auf einem Induktionsmedium mit Dexamthason gewachsen ist, erfolgte zunächst eine Inkubation in einer wässrigen 20µM Dexamethason-Lösung über Nacht bei 37°C. Erst im Anschluss daran erfolgte die Inkubation in X-Gluc-Lösung.

X-Gluc-Lösung (200ml)

100 mg X-Gluc (gelöst in 2ml Dimethylformamid) 10 mM EDTA

0,1 % Triton

100 mM Na-Phosphat-Puffer (pH 7) 0,5 mM Kalium-Ferrocyanid

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3 E Er rg ge e bn b ni is s se s e

3.1 Das korrelative Verhältnis der drei Hybridmerkmale aus den Felddaten der 21 europäischen Elite-Maisinzuchtlinien

Die Felddaten der Universität Hohenheim umfassten 21 europäische Elite-Maisinzuchtlinien und stammten aus einem faktoriellen Kreuzungsexperiment (14 x 7) mit der Bezeichnung Exp1, bestehend aus zwei verschiedenen heterotischen Gruppen, den Zahnformen (Dent) und den Hartweizenformen (Flint) sowie deren aus den interpool-Kreuzungen resultierenden 98 Hybriden (Schrag et al. 2006). Drei unterschiedliche Hybridmerkmale wurden gemessen, die Hybridleistung des Kornertrages und die der Korntrockenmasse in Prozent zum Erntezeit-punkt sowie die mittlere parentale Heterosis (MPH) des Kornertrages. Der Begriff Hybridleis-tung umschreibt dabei die absoluten Werte des Kornertrages bzw. der Korntrockenmasse der Hybride, ohne die Werte in Relation zu denen der Inzuchteltern zu stellen. Die Werte der MPH des Kornertrages hingegen stehen in Relation zu den Werten der Inzuchteltern und beschreiben den Zuwachs des Hybriden gegenüber dem mittleren Wert seiner beiden Inzucht-eltern.

Abb.9: Korrelatives Verhältnis der Hybridmerkmale.

Zu sehen sind die Felddaten der Hybridleistung (HL) vom Kornertrag und die der Korntrockenmasse und die Werte der mittleren parentalen Heterosis (MPH) vom Kornertrag der insgesamt 98 Hybride aus Experiment 1 der Universität Hohenheim (Schrag et al. 2006). Im oberen Diagramm sind die Messwerte der HL vom Kornertrag (rot) gegen die der HL der Korntrockenmasse (blau) gegeneinander aufgetragen, um deren negative Korrelation (r = -0,33; p < 0,01) anschaulich darzustellen. Bei der blauen durchgezogenen Linie handelt es sich um eine polynomische Trendlinie 3.Grades der Korntrockenmassenwerte. Im unteren Diagramm sind die Felddaten der HL (rot) und die der MPH (blau) von Kornertrag zur Veranschaulichung der positiven Korrelation (r = 0,84; p <

0,01) gegeneinander aufgetragen.

Korrelationsanalysen der drei gemessenen Hybridmerkmale offenbarten, dass diese in einem gewissen korrelativen Verhältnis zueinander standen. So existierte eine schwach, negative Korrelation (r = -0,33, p < 0,01) zwischen der Hybridleistung vom Kornertrag und der Hybridleistung der Korntrockenmasse. Ebenfalls konnte eine sehr viel stärkere, jedoch positive Korrelation (r = 0,84, p < 0,01) zwischen der Hybridleistung und MPH vom Korner-trag beobachtet werden (Abb.9).