Untersuchung der Substratstabilität potenzieller Substrate

Genetische und biochemische Untersuchungen der peroxisomalen ABC-Transporter von S. cerevisiae ergaben Hinweise darauf, dass Coenzym A aktivierte langkettige Fettsäuren das Substrat der peroxisomalen ABC-Transporter sein könnten. Da Peroxisomen auch der Ort der β-Oxidation sind, dem enzymatischen Abbau von Acyl-CoA zur Energiegewinnung, wurde zunächst die Stabilität von Lauroyl-CoA und Oleoyl-CoA bei Inkubati-on mit angereicherten peroxisomalen Membranen untersucht. Die Stabilität des Substrats innerhalb des

Mess-zeitraums war Voraussetzung für weitere Untersuchungen wie die Transversalbewegung aktivierter Fettsäuren über Biomembranen. Das Ergebnis der Untersuchung ist in Abb. 18 gezeigt.

Abb. 18: Untersuchung der Substratstabilität von ¹⁴C-Lauroyl- und ¹⁴C-Oleoyl-CoA nach Inkubation bei 18 °C mit angereicherten peroxisomalen Membranen. (A) Strukturformel der radioaktiv markierten Fettsäureanaloga, rot mar-kiert ist das ¹⁴C Nuklid. (B) DC von Lauroyl-CoA, autoradiographisch mit dem Phosphorimager detektiert. Je 250 nCi ¹⁴C-Lauroyl-CoA wurde 20 min ohne und in Gegenwart von angereicherten peroxisomalen Membranen inku-biert. K = Kontrolle ohne peroxisomale Membranen, a = mit in Hochsalzpuffer gewaschenen Membranen, b = mit in TE-Puffer gewaschenen Membranen. Das Ausgangsprodukt Lauroyl-CoA und die freie Laurylsäure sind beschriftet, unbekannte distinkte Abbauprodukte sind mit Sternen (*) gekennzeichnet. Das Diagramm zeigt eine Quantifizierung der Abbauprodukte, der Abbau beträgt bei a = 93% und bei b = 76%. (C) DC von Oleoyl-CoA. Je 250 nCi ¹⁴ C-Oleoyl-CoA wurden 20 und 40 min ohne und mit in TE-Puffer gewaschenen peroxisomalen Membranen inkubiert.

K = Kontrolle ohne Membranen, M = mit peroxisomalen Membranen. Das Ausgangsprodukt Oleoyl-CoA und die freie Ölsäure sind beschriftet, unbekannte distinkte Abbauprodukte sind mit Sternen (*) gekennzeichnet. Das Dia-gramm zeigt die densitometrisch quantifizierten Abbauprodukte, der Abbau beträgt nach 20 min ~3,8% und nach 40 min 4,7%, damit ist der Abbau deutlich geringer als in (B), aber doppelt so hoch wie bei der Kontrolle.

Das Fettsäurederivat ¹⁴C-Oleoyl-CoA wurde verwendet, weil aktivierte Ölsäure auch für spätere Transportmes-sungen eingesetzt werden sollte und ¹⁴C-Lauroyl-CoA wegen der besseren Löslichkeit in wässrigen Lösungen.

Abb. 18 Teil (A) zeigt die Strukturformeln der aktivierten Fettsäuren mit Lokalisation des ¹⁴C Nuklids. Zur Un-tersuchung der Stabilität der potenziellen Substrate wurde Lauroyl-CoA bzw. Oleoyl-CoA mit angereicherten peroxisomalen Membranfraktionen inkubiert und mittels Dünnschichtchromatographie (DC) und Autoradiogra-phie analysiert. Die peroxisomalen Membranen wurden für die Experimente aus den Nycodenz-Fraktionen se-dimentiert und in verschiedenen Puffern gewaschen. Für die Inkubation mit Lauroyl-CoA in Abb. 18 Teil (B) wurden die Membranen in EDTA haltigem TE-Puffer und in Puffer mit einer hohen Salzkonzentration gewa-schen. Beim Waschen mit Hochsalzpuffer [21] werden membranassoziierte Proteine abgetrennt, es sollten damit auch die meisten Proteine, die an der β-Oxidation von Fettsäuren beteiligt sind, abgetrennt werden, da es sich dabei überwiegend um lösliche Proteine handelt. Beim Waschen mit EDTA haltigem TE-Puffer werden dagegen zweiwertige Ionen komplexiert und stehen damit Enzymkatalysen nicht mehr zur Verfügung. Beide Proben zeig-ten bereits nach 20 min einen massiven Substratabbau, wie die densitometrische Quantifizierung mit der AIDA Software ergab. Dabei zeigte die in Hochsalzpuffer gewaschene Membranpräparation mit 93% einen noch stär-keren Abbau, als die in TE-Puffer gewaschene Probe mit 76%. Für die Inkubation mit Oleoyl-CoA in Abb. 18 Teil (C) wurden die Membranen in TE-Puffer gewaschen und 20 und 40 min bei 18 °C inkubiert. Der Abbau war mit 3,8% bzw. 4,7% deutlich geringer als bei der Inkubation mit Lauroyl-CoA in Teil (B), jedoch immer noch doppelt so hoch wie bei der Kontrolle und es waren korrespondierende Abbauprodukte (*) zu verzeichnen, die jedoch nicht näher untersucht wurden. Es ist anzumerken, dass die eingesetzte Membran bzw. tion in diesen Experimenten nicht näher definiert war, da die geringe Membranausbeute keine Proteinkonzentra-tionsbestimmung zuließ, d.h. der verringerte Abbau bei Oleoyl-CoA im Vergleich zu Lauroyl-CoA war wahr-scheinlich auf eine geringere Membranproteinkonzentration zurückzuführen.

4.1.2 Rekonstitution peroxisomaler Membranproteine

Peroxisomale Membranen hatten sich für direkte Untersuchungen als ungeeignet erwiesen, da die Substratstabili-tät nicht gewährleistet und keine ATPase AktiviSubstratstabili-tät nachweisbar war. Im rekonstituierten System existieren jedoch andere Bedingungen, da sich dort nur detergenssolubilisierbare Membranproteine einbauen lassen sollten.

Peroxisomale Membranproteine wurden wie unter 3.6.12 beschrieben mit Triton X-100 solubilisiert und in Ei-PC Proteoliposomen rekonstituiert. Um zu prüfen, ob peroxisomale Membranproteine erfolgreich rekonstituiert werden konnten, wurden die Proteoliposomen gefällt und das Sediment in einer SDS-PAGE und einer Immuno-detektion analysiert, wie in Abb. 19 zu sehen ist.

Abb. 19: In Proteoliposomen rekonstituierte peroxisomale Membranproteine. ~0,6 mg peroxisomale Membranprotei-ne aus eiMembranprotei-ner Aufreinigung wurden in Hochsalzpuffer resuspendiert und sedimentiert. Die pelletierten MembraMembranprotei-nen wurden in TE-Puffer aufgenommen und die Membranproteine mit Triton X-100 solubilisiert und in Ei-PC Vesikel re-konstituiert. (A) SDS-PAGE mit Silberfärbung. (B) Immunodetektion der peroxisomalen Markerproteine Pex11p und Pex13p.

Die SDS-PAGE und die Immunodetektion in Abb. 19 zeigen deutlich, dass es gelungen war, Triton X-100 solu-bilisierte peroxisomale Membranproteine in Proteoliposomen zu rekonstituieren. Die nachgewiesenen peroxiso-malen Markerproteine Pex11p und Pex13p sind integrale Membranproteine. Spezifische Antikörper gegen Pxa1p und Pxa2p gab es zum Versuchszeitpunkt nicht.

Bei der Herstellung der Proteoliposomen wurde zur Untersuchung der Substratstabilität SL-Oleoyl-CoA (siehe 3.6.9) zugegeben und anschließend zusammen mit dem Detergens von den Vesikeln extrahiert. Anschließend wurde die Probe mittels HPLC analysiert. Die HPLC-Spektroskopie wurden wie unter 3.6.9 beschrieben durch-geführt. Das HPLC-Spektrum in Abb. 20 Teil (A) zeigt einen dominanten Peak mit einer Retentionszeit von 23,2 min, der im Kontrollspektrum in Teil (B) nicht vorhanden ist. Im Kontrollspektrum (B) des reinen SL-Oleoyl-CoA ist die Retentionszeit 14,9 min. Im Bereich dieses Peaks ist in (A) nur ein kleiner Peak zu sehen.

Der größte Anteil der Probe eluierte von der Säule mit einer Retentionszeit, die in Vergleichsmessungen der freien SL-Ölsäure zugeordnet werden konnte.

Abb. 20: HPLC-Spektren von SL-Oleoyl-CoA vor und nach Inkubation mit Proteoliposomen aus peroxisomalen Membranproteinen. (A) HPLC Spektrum nach Inkubation mit Proteoliposomen, dominanter Peak mit Retentionszeit t= 23,2 min entspricht freier Ölsäure. (B) Kontrollspektrum von SL-Oleoyl-CoA (Retentionszeit t=14,9 min).

Zusammenfassend kann aus den Experimenten mit peroxisomalen Membranen geschlossen werden, dass sie kein geeignetes Ausgangsmaterial für ATPase- und für Transportmessungen darstellten. Neben der nicht ausreichen-den Substratstabilität bei Inkubation mit peroxisomalen Membranproteinen gestaltete sich die Isolation peroxi-somaler Membranen mit vernünftiger Ausbeute schwierig und es konnte bei angereicherten peroxisomalen Membranen im Gegensatz zu angereicherten Mitochondrien keine ATPase Aktivität gemessen werden (Daten nicht gezeigt), was wahrscheinlich auf das niedrige Expressionslevel der peroxisomalen ABC-Transporter Pxa1p-Pxa2p zurückzuführen ist.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurde das Versuchskonzept umgestellt, und es sollten epitopmarkierte Versionen der Proteine überexprimiert und aufgereinigt werden.

4.2 Aufreinigung von Pxa1p-Pxa2p