2. Ausgangssituation und Aufgabenstellung
2.3. Untersuchung der antiproliferativen Effekte von Bisubstratanaloga
Schon im allgemeinen Teil (S. 20) wurde diskutiert, dass Farnesyltransferase-Inhibitoren antiproliferative Effekte gegenüber MCF-7-Brustkrebszellen zeigen.
Bereits in früheren Untersuchungen haben sich Acylaminoacylamino-Strukturen in Form von N-Biphenylacryloyl- und N-Benzyloxycinnamoyl-Aminosäureresten als potenzielle Farnesylersatzstrukturen herausgestellt. [69] Darauf basierend sind die als Bisubstratanaloga konzipierten Verbindungen 15 – 18, 22 – 24 und 26 synthetisiert und auf ihre antiproliferative Wirksamkeit gegenüber MCF-7-Brustkrebszellen und ihre Aktivität als Farnesyltransferasehemmstoffe untersucht worden. Zwei dieser Verbindungen, 17 und 18, wurden zusätzlich im National Cancer Institut, USA in einem Screeningverfahren gegen zahlreiche Krebszelllinien getestet.
[106]
2.3.1. Synthese der 5-Acylaminoacylaminoderivate
Die Darstellung der Benzophenongrundgerüste 10 und 11 erfolgte gemäß Schema 4.
[86] Die Verbindungen 15, 17 und 18 stammen aus einer früheren Synthesereihe.
Verbindung 16 wurde aus Verbindung 12 und E-N-(4-Benzyloxycinnamoyl)-β-alanin, das aus früheren Synthesen zur Verfügung stand, nach Aktivierung als gemischtes Anhydrid gewonnen (Schema 5a). Für die Verbindungen 22 – 24 wurden die Boc-geschützten Vorstufen 19 – 21 synthetisiert, die nach Entschützen mit 4N HCl in Dioxan mit E-4-Phenylzimtsäure gemäss Schema 5b amidisch verknüpft worden sind. Zur Darstellung von Verbindung 26 wurde zunächst aus E-4-Phenylzimtsäure und Nipecotinsäure nach Aktivierung der Carbonsäure als gemischtes Anhydrid die E-N-(4-Phenylcinnamoyl)nipecotinsäure 25 synthetisiert. Diese ist anschließend auf die gleiche Weise mit der Vorstufe 12 amidisch verknüpft worden (Schema 5c).
NH
O NH O X R
O NH O O
O NH O O
O NH O
-H
-CH3
O NH O
O N O
O NH O
O N
O -CH3
-CH3
-CH3
-CH3
-CH3
-CH3 O
N O X: R:
15
X: R:
16
17
18
22
23
24
26
Schema 4: Darstellung der AAX-mimetischen Benzophenongrundstruktur aus 2-Amino-5-nitrobenzo-benzophenon und Phenyl- bzw. Tolylessigsäure. [86]
O
NH O
OH O
O NH O NH
O NH O NH HAS
Cl
O O
AS
OH O
N H
OH O
O
N OH
O O
O AS
O NH O NH AS O
O NH O NH O N O
O NH O NH O NH O O
I
I
II + III
16
19: AS = N-Methylglycin 20: AS = Phenylalanin 21: AS = Prolin
+
22: AS = N-Methylglycin 23: AS = Phenalalanin 24: AS = Prolin
I +
25
I +
26 + 12
12
12 a)
b)
c)
Schema 5: Darstellung der verschiedenen 5-Acylaminoacylamino-Derivate
(I): Isobutylchloroformiat, N-Methylmorpholin, DMF, -15°C, 5 min. Anschließend Zugabe der Aminkomponente in DMF, über Nacht gerührt, -15°C → RT.
(II) HCl 4 M in Dioxan, RT, 1h
(III) 4-Phenylzimtsäurechlorid, N-Methylmorpholin, DCM, 0°C → RT, 4h
NH O
NO2 O
R N
H2 O
NO2
O NH O
NH2
R Ar-CH2-COOH
Oxalylchlorid SnCl2
Toluol, 2h 120° EtOAC,
2h RF
11: R = H 12: R = CH3
2.3.2. Bestimmung der antiproliferativen Wirksamkeit
Der Zellkulturtest wurde an MCF-7-Brustkrebszellen durchgeführt. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Aussäung mit 1, 5 bzw. 10 µM der Hemmstoffe für 244 Stunden inkubiert. [106] In den folgenden Graphen ist der antiproliferative Effekt T/C als korrigierter Wert in % gegen die Inkubationszeit in Stunden aufgetragen. Der zytostatische Effekt T/Ccorr wurde dabei nach folgender Formel bestimmt:
T/Ccorr [%] = [(T-Co)/(C-Co)] x 100
T ist die optische Dichte des Kristallviolettextraktes des Testansatzes bei 578 nM, C die entsprechende Dichte des Kontrollansatzes und C0 der entsprechende Wert zu Beginn der Inkubation.
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time [h]
T/C [%]
1 µM 5 µM 10 µM
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time [h]
T/C [%]
1 µM 5 µM 10 µM
Antiproliferative Wirksamkeit von 15 Antiproliferative Wirksamkeit von 16
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time[h]
T/C [%]
1 µM 5 µM 10 µM
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time [h]
T/C [%]
1 µM 5 µM 10 µM
Antiproliferative Wirksamkeit von 17 Antiproliferative Wirksamkeit von 18
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time [h]
T/Ccorr [%]
1 µM 5 µM 10 µM
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time[h]
T/Ccorr [%]
1 µM 5 µM 10 µM
Antiproliferative Wirksamkeit von 22 Antiproliferative Wirksamkeit von 23
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time [h]
T/Ccorr [%]
1 µM 5 µM 10 µM
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
0 100 200 time [h]
T/Ccorr [%]
1 µM 5 µM 10 µM
Antiproliferative Wirksamkeit von 24 Antiproliferative Wirksamkeit von 26
Hierbei zeigt sich ein dosisabhängiger zytostatischer, in manchen Fällen in höheren Konzentrationen sogar zytotoxischer Effekt. Folgende Struktur-Wirkungs-Beziehungen sind zu erkennen: Die Methylgruppe am terminalen Phenylrest der AAX-mimetischen Struktur führt zu wirksameren Verbindungen als die an dieser Stelle unsubstituierten Derivate. Die 4-Phenylcinnamoylderivate sind wirksamer als die 4-Benzyloxycinnamoylverbindungen. Der Ersatz des β-Alanin-Linkers durch Glycin führt bei niedrigen Konzentrationen zu einem Wirkungsverlust. Ein Austausch der β-Alanin-Struktur durch Phenylalanin, Prolin oder Piperidin liefert nahezu unwirksame Verbindungen. Die Verbindung 22 stellt mit einem N-Methyl-Glycin-Linker und der terminalen 4-Phenylcinnamoylstruktur die wirksamste Verbindung dar.
Sie zeigt bereits bei einer Konzentration von 5 µM zytotoxische Effekte.
2.3.3. Wirksamkeit der Verbindungen 17 und 18 im NCI Zelllinien-Screening
Die Verbindungen 17 und 18 wurden im National Cancer Institut in den USA auf ihre Wirksamkeit gegenüber 60 Krebszelllinien nach literaturbeschriebenen Methoden getestet. [107] Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 Seite 58 zusammengefasst.
(GI50: Wirkstoffkonzentration, bei der 50 % Wachstumshemmung erreicht wird;
TGI: Total growth inhibition = Wirkstoffkonzentration, bei der vollständige Wachstumshemmung eintritt. LC50: Wirkstoffkonzentration, bei der die Anzahl der Zellen um 50 % zurückgeht).
Die GI50-Werte liegen überwiegend im niederen mikromolaren Bereich und unterscheiden sich bei den beiden Verbindungen kaum. Die TGI-Werte sind ebenfalls sehr ähnlich, die LC50-Werte zeigen in einigen Fällen signifikante Unterschiede.
Diese Ergebnisse weisen auf eine eher unspezifische Toxizität hin.
2.3.4. Wirksamkeit der 5-Acylaminoacylaminoderivate gegenüber FTase Die 5-Acylaminoacylaminoderivate wurden auch auf ihre Wirksamkeit gegenüber Farnesyltransferase getestet. Die IC50-Werte sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
R IC50 (µM) R IC50 (µM)
15 O
NH O NH O NH O O
22 22 O
NH O NH O N O
10
16 NH
O NH
O
O NH
O O
14 23
O
O NH O NH O
NH 32
17 O
NH O NH O NH
O 9.3 24
O
O NH O NH O
N 25
18
O
O NH O NH O
NH 36 26 O
NH O NH O N
O 30
Tab. 4: Wirksamkeiten der 5-Acylaminoacylaminoderivate im FTI-in-vitro-Test.
Verbindung 18 Verbindung 17
Panel/Cell Line GI5O TGI LC5O GI5O TGI LC5O
Leukemia
CCRF-CEM 4.78E-06 1.71E-05 4.94E-05 2.16E-06 8.84E-06 9.71E-05 HL-60 (TB) 7.44E-06 2.07E-05 4.82E-05 1.69E-05 5.44E-05 >1.00E-04 K-562 3.33E-06 1.03E-05 3.21E-05 1.11E-05 >1.00E-04 >1.00E-04 MOLT-4 3.50E-06 1.53E-05 3.92E-05 4.17E-06 9.16E-06 >1.00E-04 RPMI-8226 1.04E-05 2.92E-05 8.22E-05 2.40E-06 1.47E-05 8.02E-05 SR 1.84E-06 4.95E-06 1.67E-05
Non-Small Cell Lung Cancer
A549/ATCC 2.03E-06 5.37E-06 2.09E-05 1.77E-06 4.32E-06 1.16E-05 EKVX 3.47E-06 1.58E-05 4.71E-05 1.32E-06 3.58E-06 9.71E-06 HOP-62 2.56E-06 6.95E-06 2.67E-05 2.11E-06 4.15E-06 8.18E-06 HOP-92 4.17E-06 1.54E-05 4.45E-05
NCI-H226 2.79E-06 8.39E-06 3.49E-05 2.42E-06 6.15E-06 2.42E-05 NCI-H23 2.06E-06 4.71E-06 1.21E-05 1.85E-06 4.20E-06 9.50E-06 NCI-H322M 5.21E-06 2.46E-05 >1.00E-04 3.47E-06 1.77E-05 >1.00E-04 NCI-H460 2.86E-06 1.11E-05 3.72E-05 1.88E-06 4.60E-06 1.70E-05 NCI-H522 5.13E-06 1.84E-05 4.73E-05
Colon Cancer
COLO 205 6.93E-06 3.20E-05 >1.00E-04 1.75E-06 4.53E-06 1.39E-05 HCC-2998 1.68E-06 4.98E-06 1.84E-05 2.37E-08 1.61E-06 8.20E-06 HCT-116 1.37E-06 2.65E-06 5.15E-06 1.12E-06 2.96E-06 7.82E-06 HCT-15 3.69E-06 1.32E-05 3.63E-05 2.71E-06 9.53E-06 4.04E-05 HT29 1.58E-06 2.99E-06 5.65E-06 5.06E-06 2.03E-05 6.63E-05 KM12 3.57E-06 1.45E-05 4.49E-05 2.93E-06 1.46E-05 >1.00E-04 SW-620 4.75E-06 1.95E-05 8.73E-05 1.57E-06 3.44E-06 7.50E-06
CNS Cancer
SF-268 2.46E-06 7.51E-06 3.29E-05 2.62E-06 9.47E-06 7.41E-05 SF-295 2.22E-06 4.86E-06 1.19E-05 1.36E-06 3.05E-06 6.84E-06 SF-539 2.70E-06 8.85E-06 3.69E-05 1.68E-06 3.67E-06 8.03E-06 SNB-19 4.57E-06 2.03E-05 7.08E-05 3.06E-06 1.60E-05 8.55E-05
SNB-75 1.93E-06 6.59E-06 3.26E-05
U251 2.77E-06 8.67E-06 3.24E-05 1.85E-06 4.35E-06 1.07E-05
Melanoma
LOX IMVI 3.69E-06 1.34E-05 3.88E-05 2.03E-06 4.84E-06 1.45E-05 MALME-3M 2.99E-06 1.23E-05 7.73E-05 3.39E-06 1.15E-05 6.06E-05 M14 4.81E-06 1.73E-05 5.31E-05 2.57E-06 7.30E-06 3.13E-05 SK-MEL-2 1.39E-05 3.53E-05 8.99E-05 1.89E-06 5.79E-06 2.25E-05 SK-MEL-28 1.17E-05 6.66E-05 >1.00E-04 3.04E-06 9.00E-06 3.95E-05 SK-MEL-5 1.69E-06 6.32E-06 2.60E-05 2.10E-06 5.14E-06 1.60E-05 UACC-257 6.33E-06 2.27E-05 6.35E-05 2.05E-06 4.71E-06 1.23E-05 UACC-62 1.31E-05 3.08E-05 7.27E-05 2.17E-06 4.87E-06 1.30E-05
Ovarian Cancer
IGROV1 8.25E-06 2.17E-05 5.11E-05 9.75E-07 2.16E-06 4.72E-06 OVCAR-3 4.97E-06 1.91E-05 4.93E-05 1.88E-06 4.32E-06 9.89E-06
OVCAR-4 1.48E-06 3.41E-06 7.82E-06
OVCAR-5 4.48E-06 2.31E-05 >1.00E-04 2.09E-06 5.77E-06 2.79E-05 OVCAR-8 1.59E-06 3.27E-06 6.73E-06 8.72E-07 2.21E-06 5.12E-06 SK-OV-3 1.07E-05 2.74E-05 6.98E-05 1.85E-06 4.36E-06 1.07E-05
Renal Cancer
786-0 2.27E-06 5.47E-06 1.88E-05 1.60E-06 3.34E-06 6.97E-06 A498 9.89E-07 8.73E-06 3.27E-05 2.31E-06 5.31E-06 1.74E-05 ACHN 4.79E-06 1.62E-05 4.17E-05 3.08E-06 1.09E-05 4.17E-05 CAKI-1 4.89E-06 2.04E-05 6.05E-05 3.29E-06 1.13E-05 7.09E-05 RXF 393 2.38E-06 6.60E-06 2.36E-05 1.46E-06 3.52E-06 8.50E-06 SN12C 2.74E-06 9.93E-06 3.69E-05 1.92E-06 5.51E-06 2.62E-05 TK-10 2.08E-06 5.95E-06 2.56E-05 2.78E-06 8.72E-06 >1.00E-04 UO-31 1.18E-05 2.47E-05 5.18E-05 3.67E-06 1.37E-05 3.71E-05
Prostate Cancer
PC-3 1.98E-06 4.07E-06 8.37E-06 1.46E-06 3.48E-06 8.25E-06 DU-145 2.49E-06 7.54E-06 3.59E-05 3.93E-06 >1.00E-04 >1.00E-04
Breast Cancer
MCF7 1.81E-06 3.69E-06 7.51E-06 1.72E-06 4.92E-06 3.09E-05 NCI / ADR-RES 9.71E-06 2.98E-05 9.02E-05 5.41E-06 >1.00E-04 >1.00E-04 MDA-MB-231/ATCC 2.62E-06 9.21E-06 3.40E-05 1.87E-06 5.64E-06 2.45E-05 HS 578T 4.71E-06 2.11E-05 9.11E-05 1.73E-06 3.74E-06 8.07E-06 MDA-MB-435 3.67E-06 1.61E-05 4.76E-05 3.27E-06 1.08E-05 4.32E-05 MDA-N 4.74E-06 2.09E-05 7.99E-05 2.50E-06 6.61E-06 2.53E-05 BT-549 1.09E-05 2.40E-05 5.27E-05 1.46E-06 3.11E-06 6.64E-06 T-47D 1.76E-06 3.89E-06 8.62E-06 2.85E-06 1.80E-05 >1.00E-04
Tab. 3: Ergebnis des NCI Krebszelllinien-Screenings der Verbindungen 17 / 18. Erklärung auf S. 57.
Es zeigen sich ähnliche Struktur-Wirkungs-Beziehungen wie bei der Testung der antiproliferativen Effekte: Wie schon bei dem entsprechenden Cystein-Derivat 11 (Schema 3, S. 45) zeigt auch hier die methylsubstituierte AAX-Ersatzstruktur in Verbindung 16 bessere Wirksamkeit gegenüber der FTase als das entsprechende unsubstituierte Derivat 15. Das 4-Phenylcinnamoylderivat 17 ist aktiver als das entsprechende 4-Benzyloxycinnamoylderivat 16. Ebenso führt auch hier der Ersatz der β-Alanin-Struktur zu niedrigeren Aktivitäten.
Obwohl diese Verbindungen ursprünglich als Bisubstratanaloga der FTase konzipiert worden sind und die Struktur-Wirkungs-Beziehungen der FTase-Hemmung und des antiproliferativen Effekts ähnlich sind, sprechen dennoch zwei Gründe dafür, dass die FTase-Hemmung nicht der Mechanismus des antiproliferativen Effekts ist: Der antiproliferative Effekt wird bei niedrigeren Konzentrationen erreicht als die Hemmung der Prenylierung, und Verbindung 18 zeigt deutliche antiproliferative Effekte, obwohl ihre Aktivität gegenüber der FTase mit 36 µM sehr schwach ist. Es scheint sich demnach bei diesen Verbindungen um eine neue Klasse antiproliferativ wirkender Stoffe zu handeln, deren Wirkungsmechanismus noch zu klären ist.
Ergebnisse früherer Untersuchungen zu Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden bestätigt. Eine Fortführung dieses Ansatzes erscheint daher sinnvoll, ist aber nicht Gegenstand dieser Arbeit.
2.4. Untersuchung von