Über alle Gruppen hinweg deuten demnach die Befunde von Zeitfenster 13 einen Wirkungsverlust an, nach weiteren 4 Wochen (Zeitfenster 14) ist eine Wirkung nicht mehr erkennbar.
Für die Parameter Zahl der Pulse und maximale Pulsamplitude konnten keine zeitabhängigen Effekte festgestellt werden. Dabei fällt auf, dass sich sowohl vor als auch nach der Implantation Zeitfenster ergaben, in denen keine Pulse feststellbar waren.
Diese hielt bis zum Tag 210 (30 Wochen/5040 h) an (p = 0,001). Nach 238 Tagen (34 Wochen/5712 h) wurde ein leichter Anstieg festgestellt, nach 38 Wochen war kein Unterschied mehr festzustellen (p > 0,2).
Daraus ergab sich anhand der LH-Einzelwertbestimmung eine Wirkdauer von 238 Tagen, bzw. eine Downregulationszeit von 210 Tagen.
Tab.21: Ergebnisse der punktuellen LH-Messungen (ng/ml) der einzelnen Hündinnen vom Zeitpunkt direkt vor Implantatgabe (Zeit: 0 h) bis 42 Wochen nach Implantatgabe (Zeit:
7056 h), Mittelwert (Ш) und Standardabweichung (SD) Zeit
h (Wo)
Maja Flo Pat Ela Oda Kim Lilli Fox Cleo Ш SD
0 7,1 5,6 3,1 13,4 5,6 5,5 15,5 7,6 4,6 7,6 3,9
1 14,9 14,5 13,3 17,1 10,2 16,7 16,4 13,6 12,4 14,3 2,1 2 10,8 12,6 10,5 14,0 9,4 12,5 12,8 11,2 9,5 11,5 1,5
4 8,9 10,1 8,3 12,4 7,8 9,7 13,7 9,9 8,6 9,9 1,8
6 8,3 7,8 7,5 13,2 6,7 7,6 13,9 8,7 7,2 9,0 2,5
8 9,2 9,3 7,2 11,9 7,9 7,1 12,8 9,0 7,3 9,1 1,9
24 8,0 8,0 5,8 10,8 6,2 6,9 14,5 9,1 6,5 8,4 2,6
32 7,1 9,6 4,9 11,5 6,2 5,4 11,9 8,7 7,2 8,0 2,4
48 7,7 9,8 5,3 10,9 4,8 5,2 11,8 8,4 * 8,0 2,5
56 7,5 7,4 5,1 8,9 5,3 3,7 9,6 7,8 5,7 6,8 1,8
72 6,5 7,0 4,6 8,0 5,2 5,0 9,5 7,2 5,5 6,5 1,5
80 5,5 7,7 4,8 8,0 5,5 4,5 8,4 7,0 5,7 6,3 1,4
96 7,7 7,4 5,1 6,4 4,9 4,4 8,3 5,2 5,9 6,2 1,3
104 6,5 5,6 4,4 6,7 4,9 4,7 7,2 4,8 5,5 5,6 1,0
120 4,9 6,1 4,0 6,6 4,8 4,0 7,1 5,5 5,7 5,4 1,0
168 (1) 4,5 5,4 3,1 5,7 4,3 3,8 6,0 5,0 5,2 4,8 0,9 336 (2) 2,1 2,1 3,5 4,6 2,2 4,0 4,6 1,6 4,7 3,3 1,2 504 (3) 3,6 3,4 2,3 3,1 2,0 2,7 3,5 3,5 1,9 2,9 0,6 672 (4) 3,7 1,4 2,0 4,9 2,3 3,4 4,4 0,6 4,5 3,0 1,4 1008 (6) 3,6 2,8 1,5 3,3 1,7 3,8 3,2 1,5 3,3 2,7 0,9 1680 (10) 3,8 3,4 2,0 2,7 1,7 2,5 2,3 1,8 3,3 2,6 0,7 2352 (14) 1,7 1,2 1,7 3,4 1,8 2,2 3,1 3,0 1,1 2,1 0,8 3024 (18) 1,9 1,5 1,4 3,2 1,6 1,4 3,3 3,2 2,2 2,2 0,8 3696 (22) 3,4 0,7 1,7 3,1 1,1 1,8 1,4 1,7 3,3 2,0 1,0 4368 (26) 2,6 1,4 1,3 1,2 1,3 1,3 1,1 1,7 3,0 1,6 0,6 5040 (30) 1,0 5,5 1,2 3,3 1,7 0,8 4,2 1,4 1,8 2,3 1,5 5712 (34) 0,5 7,0 2,6 7,3 5,4 3,9 7,7 1,8 5,1 4,6 2,4 6384 (38) 3,5 6,6 6,8 11,6 7,3 4,4 16,6 7,3 8,6 8,1 3,7 7056 (42) 4,8 9,2 6,6 9,1 9,2 7,9 12,4 9,2 10,4 8,7 2,0
* ungenügend Plasma vorhanden
LH-Einzelmesspunkte 024681012141618 06121824303642485460667278849096102108114 Zeit (h)
LH ( ng /m l)
LH-Einzelmesspunkte 024681012141618 0100820163024403250406048 Zeit (h)
LH (n g/m l)
Abb. 25: Mittlerer Verlauf (Ш ± SD) der LH-Werte vor (0) und nach Implantation (1-120 h) in punktuell gewonnenen Blutproben Abb. 26: Mittlerer Verlauf (Ш ± SD) der LH-Werte vor (0) und nach Implantation (1-7056 h) in punktuell gewonnenen Blutproben
5 Diskussion
Fragestellung, Versuchsdesign, Methodik
Alternativen zur chirurgischen Kastration sind heute insbesondere in der Kleintierpraxis vermehrt vorgebrachte Forderungen. Diese ergeben sich einmal aus ethischen Gründen, d.h.
die Tierhalter wollen eine Operation und die damit verbundene Entfernung der Gonaden auf alle Fälle vermeiden. Daneben ergibt sich die Forderung aber auch aus medizinischen Indikationen, z.B. dass ein echtes Narkoserisiko besteht oder aber dass allenfalls eine temporäre, d.h. befristete, Hemmung der Gonadenfunktion gewünscht wird.
In der Praxis wurden diesbezügliche Erfahrungen bisher insbesondere mit Rüden gemacht, wobei die temporäre Kastration durch Anwendung eines GnRH-Implantates mit nachfolgender Downregulation der hypophysären GnRH-Rezeptoren erreicht wurde (Riesenbeck et al. 2002).
Zu dieser Möglichkeit der Unterdrückung der Gonadenfunktion lagen Erfahrungen bei der Hündin bis jetzt nicht vor. Bisher erschienene Erfolgsberichte beziehen sich ausschließlich auf die Anwendung bei präpubertären Hündinnen, bei denen mittels Downregulation eine deutliche Verschiebung des Eintrittes des ersten Östrus erreicht werden konnte (CONCANNON et al. 1988, RUBION et al. 2004, TRIGG et al. 2004). Die Unterdrückung der Läufigkeit bzw. die Läufigkeitsverschiebung bei geschlechtsreifen Hündinnen basiert deshalb nach wie vor auf der Anwendung von Gestagenen. Dieses Verfahren wird weltweit praktiziert; im Hinblick auf die - auch in Abhängigkeit vom Präparat - beobachteten Nebenwirkungen, wie die vermehrte Inzidenz von Mammatumoren oder das Auftreten von Endokrinopathien (COX 1970, WITHERS & WHITNEY 1967, EVANS & SUTTON 1989, JOHNSTON et al. 2001b), wäre es wünschenswert, auch dazu wirksame Alternativverfahren zur Verfügung zu haben.
Ziel vorliegender Untersuchungen war es daher, in einem Modellversuch zu überprüfen, inwieweit durch Verabreichung eines GnRH-wirksamen Implantates bei der Hündin der Effekt der Downregulation der hypophysären GnRH-Rezeptoren erreicht werden kann. Da sich das Ergebnis einer solchen Downregulation in einer Hemmung der LH- und
FSH-Sekretion manifestiert (CLAYTON 1982, D´OCCHIO & ASPDEN 1999), wurde als Maßstab für eine erfolgte Downregulation die LH-Sekretionscharakteristik erfasst.
Nachdem weiterhin die bisher in der Praxis gemachten Erfahrungen nach Anwendung eines GnRH-Implantates bei intakten, geschlechtsreifen Hündinnen zu offensichtlich unklaren und nur schwer interpretierbaren Ergebnissen geführt hatten, (HOFFMANN 2000, persönliche Mitteilung), wurden die vorliegenden Untersuchungen an ovariohysterektomierten Hündinnen durchgeführt. Durch die Ovariohysterektomie sollte ausgeschlossen werden, dass negativ rückkoppelnde Mechanismen gonadaler Steroide überlagernd zur Wirkung des GnRH-wirksamen Implantates die LH-Freisetzung beeinflussen. Es wurde erwartet, dass an diesem Modell „echte Werte“ für die durch das GnRH-Implantat induzierte Hemmung der LH- Sekretion erhalten werden können. Analog zur Situation beim Rüden (RIESENBECK et al. 2002) wurde davon ausgegangen, dass an diesem Modell die initiale Aufregulierung der Gonadenfunktion, die nachfolgende Phase des Rückgangs der LH-Sekretion auf Basalwerte, die Dauer der basalen LH-Sekretion sowie das „Wieder in Gang kommen“ der Gonadenfunktion nach Wirkungsverlust des Implantates erfasst werden können.
Weiteres Ziel vorliegender Untersuchungen war es, Hinweise auf Dosis-Wirkungsbeziehungen zu erhalten. Demzufolge wurden drei Gruppen zu je drei Tieren mit der einfachen (3,3 mg/Implantat), der doppelten (6,6 mg/Implantation) und der vierfachen Dosis (13,2 mg/Implantation) behandelt. Bei dem GnRH-Analogon handelt es sich um den Wirkstoff Buserelinazetat, die verabreichten Implantate entsprachen von der Galenik dem für die Humanmedizin zugelassenen Präparat Profact®.
Alle Hündinnen wurden im Diöstrus ovariohysterektomiert. Die zu diesem Zeitpunkt gemessenen Progesteronwerte lagen im Mittel bei 36,0 ± 16,3 ng Progesteron. Es war also davon auszugehen, dass präoperativ mit der charakteristischen, auf niedrigem Niveau verlaufenden LH-Freisetzung gerechnet werden konnte (HOFFMANN & SCHNEIDER 1993). Aufbauend auf dieser Beobachtung wurde weiter davon ausgegangen, dass nach Entfernung der Ovarien und der damit verbundenen Aufhebung der negativ rückkoppelnden Wirkung von Progesteron, eine deutliche Steigerung der LH-Sekretion
erfolgt; ein Ausbleiben dieses Anstiegs würde darauf hinweisen, dass ggf. eine Endokrinopathie vorliegt.
Da auch beim Hund eine pulsatile LH-Freisetzung beschrieben wurde (CONCANNON et al. 1989, CONCANNON 1993, JEFFCOATE 1993, KOOISTRA et al. 1999a) wurde auch in vorliegender Arbeit entsprechend früherer Untersuchungen (SCHNEIDER 1992) die Charakteristik der LH-Freisetzung im Rahmen so genannter „Zeitfenster“ erfasst. Bei einem Zeitfenster handelt es sich um einen Zeitraum von 6 Stunden, bei dem im Abstand von 20 Minuten Blutproben zur Bestimmung von LH entnommen wurden. Das erste Zeitfenster lag mindestens 10 Tage vor der Ovariohysterektomie, Zeitfenster 2 und 3 wurden auf die Tage 21 und 35 nach der Ovariohysterektomie festgesetzt. Die Zeitfenster 4, 5 und 6 ergaben sich 14, 28 und 42 Tage nach Behandlungsbeginn, danach folgten Zeitfenster im Abstand von 4 Wochen, bis die LH-Werte wieder das Ausgangsniveau vor Behandlungsbeginn erreicht hatten. In diesem Versuchsdesign dienten die Tiere demzufolge als ihre eigene Kontrolle. Wie bereits früher beschrieben (HOFFMANN &
SCHNEIDER 1993), wurde auch in vorliegender Arbeit zur Beschreibung der LH-Sekretion für jedes Zeitfenster die AUC (area under the curve), der Basalwert, die Zahl der Impulse sowie die maximale Impulsamplitude (Cmax) erfasst.
Parallel zur Erfassung von LH im Rahmen der Zeitfenster wurden auch Einzelblutproben zunächst in stündlichen, dann in täglichen und schließlich in 14- bis 28-tägigen Abständen entnommen. Im Vergleich mit den während der Zeitfenster erhaltenen Ergebnissen sollten die LH-Messungen in diesen Blutproben einen Hinweis darauf geben, inwieweit in der Praxis durch Einzelmessungen von LH auf die Wirksamkeit des Implantates geschlossen werden kann.
Zur Bestimmung von LH kam ein hier etablierter (HOFFMANN, unveröffentlichte Ergebnisse) Enzym-Immuno-Assay (EIA) zur Anwendung. In diesem Test wurden Mikrotiterplatten zunächst mit einem 2. Antikörper (Goat-anti-mouse IgG FC spezifisch) beschichtet, danach erfolgte die Beschichtung mit dem ersten, monoklonalen Antikörper 518B7 Mouse-Antibovine, der uns dankenswerter Weise von Prof. Dr. Janet Roser, University of California, Davis, zur Verfügung gestellt worden war. Dieser Antikörper
weist eine hohe Kreuzaktivität mit LH-unterschiedlicher Spezies auf (MATERI et al.
1987). Um eine möglichst hohe Empfindlichkeit zu erreichen, wurde der Test als Sequenztest angesetzt (STRECKER et al. 1997), d.h. das als Tracer dienende biotinylierte bovine LH (USDA bLH1-1) wurde 24 Stunden nach Inkubation mit dem ersten Antikörper zugesetzt. Als Standard diente canines LH (LER-1685-1). Mit diesem heterologen Test ergaben sich gut reproduzierbare Werte, der Intra-Assay-Variationskoeffizient lag im hohen Bereich bei 9,8 % und bei 18,6 % im niedrigen Bereich. Die entsprechenden Inter-Assay-Variationskoeffizienten lagen bei 6,5 bzw. 29,2 %. Bei Verdünnung von Blutproben mit hohem LH-Gehalt ergaben sich lineare Regressionen. Der entwickelte LH-Test erwies sich demnach als zuverlässig, der erhaltene Datensatz lässt relevante Ergebnisse im Hinblick auf erzielbare bzw. nicht erzielbare Effekte erwarten.
Ergebnisse
Wie in Kapitel 4.2 dargestellt, kam es in den Zeitfenstern 2 und 3 im Vergleich zum Zeitfenster 1 zu einer signifikanten Erhöhung der AUC sowie der Basalwerte (p < 0,001) von LH. Dies zeigt den erwarteten Anstieg der Verfügbarkeit von LH. Dysfunktionen der Hypothalamus-Hypophysenachse bei den in den Versuch aufgenommenen Hunden können demzufolge ausgeschlossen werden.
Gemessen an der AUC sowie den Basalwerten ergab sich mit p < 0,0001 ein hochsignifikanter Behandlungseffekt. Kein Effekt zeigte sich dagegen für die Zahl der LH-Pulse pro Zeitfenster sowie die maximale Ampliltudenhöhe (Cmax); bei dem Parameter Zahl der Pulse fällt auf, dass sich sowohl vor als auch nach der Implantation Zeitfenster ergaben, in denen keine Pulse feststellbar waren.
Überrascht hat der Befund, dass sich bei den auf die Behandlung hochsignifikant verändernden Parametern AUC und Basalwerte keine Abhängigkeiten von der verabreichten Dosis zeigten (Implantation von 3,3; 6,6 und 13,2 mg Wirkstoff). Dieser Befund läst darauf schließen, dass in vorliegenden Untersuchungen und in dem gewählten Tiermodell (kastrierte weibliche Beaglehündinnen) bereits die niedrigste Dosis zu einer maximalen Wirkung führte, die durch eine Dosiserhöhung nicht mehr steigerbar war.
Die für die drei Gruppen erhaltenen Befunde können demnach zusammengefasst und einheitlich dahingehend interpretiert werden, dass bereits im 4. Zeitfenster, d.h. 14 Tage nach der Implantation, die AUC und die Basalwerte auf das unterste erreichbare Niveau abgefallen waren. Über die folgenden neun Zeitfenster zeigten sich keine Veränderungen, im 14. Zeitfenster, d.h. 266 Tage nach der Implantation, waren die Ausgangswerte wieder erreicht. Bereits im 13. Zeitfenster war bei allen drei Gruppen ein erster Anstieg zu erkennen; dieser war nur für die Gruppe 2 gemessen an der AUC und dem Basalwert im Vergleich zu Zeitfenster 12 statistisch signifikant (p < 0,05). Die vorliegenden Untersuchungen haben demnach über alle Gruppen hinweg eine einheitliche Wirkungsdauer von 238 Tagen ergeben, gerechnet ab dem Zeitpunkt der Implantation.
Die Phase der Downregulation selbst lag bei 224 Tagen. Während der Phase der Downregulation ergab sich für die AUC (Шg, SF) über alle Gruppen hinweg ein Durchschnittswert von 762,0 (1,3) ng/ml*min, der entsprechende Wert für die Basalwerte (Шg, SF) lag bei 2,0 (1,4) ng/ml. Diese Werte liegen noch unter jenen Werten (p < 0,01), wie sie im ersten Zeitfenster unter der negativ rückkoppelnden Wirkung von Progesteron gemessen wurden [AUC 1133,2 (1,29) ng/ml*min, Basalwert 2,72 (1,31) ng/ml]. Aus diesen Befunden kann in Verbindung mit den Ergebnissen von HOFFMANN &
SCHNEIDER (1993) zur LH Sekretion während des Diöstrus und deren Stimulierbarkeit durch GnRH geschlossen werden, dass die unter der Downregulation gemessene LH-Freisetzung als eine Basalsekretion zu interpretieren ist, die Verfügbarkeit von LH liegt noch unterhalb der im ersten Drittel des Diöstrus gemessenen.
Die in Abb. 25 und 26 sowie in Tab.21 zusammengefassten Ergebnisse der punktuellen LH-Messungen lassen erkennen, dass unmittelbar nach Verabreichung der Implantate die LH-Werte im Blutplasma angestiegen waren. Diese waren nach einer Stunde etwa doppelt so hoch wie die Ausgangswerte. Das Niveau der Ausgangswerte war nach ca. 6 Std. wieder erreicht. Erstmals lagen nach 120 Stunden (5 Tagen) die durchschnittlichen LH-Konzentrationen signifikant (p < 0,05) unter den Ausgangskonzentrationen. Von diesem Zeitpunkt an ergab sich über die gesamte Phase der Downregulierung ein gleich bleibend niedriges Niveau der LH-Konzentrationen. Das heißt, ab diesem Zeitpunkt (Zeitpunkt 120 h) kann von einer Manifestation der Downregulierung gesprochen werden. Auch bei
den punktuellen LH-Messungen zeigte sich das Nachlassen der Implantatwirkung durch einen Anstieg der durchschnittlichen LH-Konzentrationen; so ergab sich für die 34. Woche noch ein signifikanter Unterschied zu den Ausgangskonzentrationen (p > 0,02), in der 38.
Woche war dieser nicht mehr gegeben.
Bei dem unmittelbar nach der Implantation festgestellten Anstieg der LH-Konzentrationen handelt es sich um ein erwartetes Ereignis. Verschiedene Untersuchungen (MC RAE et al. 1985, CONCANNON 1989, VICKERY et al. 1989, TRIGG et al. 2004) haben gezeigt, dass in Folge dieses Anstieges ein Östrus auftrat (präpubertäre Tiere), bzw.
bei geschlechtsreifen Hündinnen die Läufigkeit induziert wurde. In letzteren Fällen hatten die Behandlungen in den Phasen Proöstrus, später Diöstrus und früher Anöstrus des Sexualzyklus stattgefunden. Daraus ergibt sich, dass - anders als z.B. beim Rüden (RIESENBECK et al. 2002)- der Erfolg der Downregulation und der dadurch induzierten zeitlich befristeten hormonellen Kastration, an den Zeitpunkt der Behandlung während des Sexualzyklus gebunden ist. Unbeschadet der neuroendokrinen Umstellung der Hypothalamus-Hypophysenvorderlappen-Gonadenachse beim Übergang vom Diöstrus in den Anöstrus, scheint das System immer noch die notwendige Empfindlichkeit aufzuweisen, um auf eine vermehrte Verfügbarkeit von GnRH und demzufolge von LH mit dem Eintreten von Östrus und Läufigkeit zu reagieren. Diese Ansprechbarkeit der neuroendokrinen Regulation der Fortpflanzung bei der Hündin zeigt sich auch an der Tatsache, dass – wie oben festgestellt – zu jedem Zeitpunkt LH – wenn auch in verringerten Mengen – verfügbar ist. Offensichtlich reichen diese Mengen aus, um z.B. durch Induktion der Synthese von LH-Rezeptoren an den Zielzellen im Ovar jederzeit die notwendige Ansprechbarkeit zu garantieren. Um diese initiale stimulierende Wirkung eines GnRH-Implantates zu umgehen, bietet sich an, die Behandlung in das 1. Drittel des Diöstrus zu legen, also die Zyklusphase, in der die hohen Progesteronkonzentrationen eine deutliche, negativ rückkoppelnde Wirkung auf den Hypothalamus ausüben und eine Freisetzung von LH nach Applikation von GnRH nicht möglich ist (HOFFMANN & SCHNEIDER 1993).
Hier ist allerdings zu berücksichtigen, dass die Progesteronverlaufskurven bei Haushunden durchaus unterschiedlich sein können (HOFFMANN & GERRES 1989), so dass man nicht pauschal einen Behandlungszeitraum von z.B. 5 bis 15 Tage nach Ende der Läufigkeit (Östrusende) angeben kann. Vielmehr sollte die Implantation an einen ausreichend hohen
Progesteronwert gekoppelt sein. Entsprechende Referenzwerte liegen allerdings noch nicht vor, so dass allenfalls vermutet werden kann, dass Werte > 10 ng/ml Plasma erreicht sein müssen.
Eine weitere denkbare Lösung könnte darin bestehen, das zusätzlich freigesetzte LH durch Anwendung eines Antiserums zu blockieren. Ein solches Vorgehen hat sich als erfolgreich erwiesen bei der Blockade von überschüssigem eCG bei Anwendung eines entsprechenden Antiserums (Neutra-PMSG®) im Rahmen des Embryotransfer.
Zusammenfassend ergibt sich also, dass durch Verabreichung eines GnRH-wirksamen Implantates bei der Hündin eine Downregulierung mit nachfolgender weitgehender Hemmung der LH-Freisetzung erzielt werden kann. Die verbliebene Verfügbarkeit entspricht annähernd den Werten, wie sie unter der negativ-rückkoppelnden Wirkung von Progesteron im frühen Diöstrus gemessen werden. Eine Applikation sollte in dieser Phase des Sexualzyklus erfolgen, da vermutlich nur in dieser Phase die initiale Freisetzung von LH unterbleibt, eine Downregulation der GnRH-Rezeptoren jedoch stattfindet. Dieser These wäre in weiteren Versuchen nachzugehen.
6 Zusammenfassung
In vorliegenden Untersuchungen sollte geklärt werden, inwieweit bei der Hündin durch Applikation eines GnRH wirksamen Präparates in unterschiedlichen Dosierungen eine Downregulation der hypophysären GnRH-Rezeptoren und damit eine Hemmung der LH-Freisetzung als Voraussetzung für den Effekt einer zeitlich befristeten hormonellen Kastration erreicht werden kann. Die Untersuchungen wurden an Gruppen zu je drei Beaglehündinnen durchgeführt, denen jeweils 3,3, 6,6 bzw. 13,2 mg des GnRH wirksamen Analogons Buserelin in Form eines Implantates verabreicht worden waren. Die Charakterisierung der LH-Freisetzung erfolgte dabei primär anhand von Zeitfenstern, wobei sich ein Zeitfenster über eine Spanne von 360 min erstreckte in der Blutproben in 20 min Intervallen zur LH-Bestimmung entnommen wurden. Parallel dazu erfolgten Einzelblutprobenentnahmen, die – angepasst an den erwarteten Verlauf der LH-Freisetzung – zunächst in stündlichen Intervallen und letztlich in 28tägigen Intervallen erfolgten. Um möglich Einflüsse negativ rückkoppelnder Wirkungen von Ovarhormonen ausschließen zu können, wurden die Untersuchungen an ovariohysterektomierten Tieren durchgeführt. Die Operation wurde, kontrolliert am Verlauf der Progesteronwerte, in der Phase des Diöstrus durchgeführt, alle Tiere reagierten als Zeichen eine intakten Hypothalamus-Hypophysen-Gonadenachse nach Entfernung der Ovarien (Wegfall negativer Feetbackmechanismen) mit dem erwarteten Anstieg der Verfügbarkeit von LH.
Die Tiere dienten als ihre eigenen Kontrollen, d. h. vor der Implantation wurden zwei Zeitfenster platziert. Die Platzierung der Zeitfenster nach der Implantation erfolgte 14, 28 und 42 Tage danach, weitere Zeitfenster erfolgten bis zum Versuchsende in 4-wöchigen Abständen. Als Versuchsende wurde der Zeitpunkt definiert, an dem die Verfügbarkeit von LH wieder der vor der Implantation entsprach.
Bereits 14 Tage nach der Implantation zeigte sich eine signifikante Verminderung der Verfügbarkeit von LH (p < 0,0001) gemessen an der AUC und der LH-Basalkonzentration.
Die Zahl der pro Zeitfenster erfassten LH-Pulse sowie deren Amplitude war dabei nicht verändert. Ein entsprechender Effekt zeigte sich bei der Bestimmung von LH in den punktuell entnommenen Blutproben. Dosiseffekte ergaben sich nicht, über alle Gruppen hinweg lag, gemessen ab dem Zeitpunkt der Implantation, die Phase der Downregulation
bei 238 Tagen. Die während der Phase der Downregulation noch messbare LH Sekretion ist als „Basalsekretion“ zu interpretieren, die diejenige im ersten Drittel des Diöstrus (maximale negative rückkoppelnde Wirkung ovarieller Steroide) unterschreitet.
Die punktuellen Blutentnahmen zeigen, dass in den ersten Stunden nach der Verabreichung des GnRH-wirksamen Implantates eine deutliche Steigerung der LH Sekretion festzustellen ist. In Abhängigkeit vom Stadium des Reproduktionszyklus (z. B. Anöstrus) kann durch diesen Anstieg eine Läufigkeit induziert werden. Daraus wird gefolgert, dass eine Behandlung zur Läufigkeitsunterdrückung in das erste Drittel des Diöstrus zu legen ist, in der auf Grund der negativ rückkoppelnden Wirkung ovarieller Steroide durch GnRH eine LH Freisetzung nicht provoziert werden kann, wohl aber mit dem Eintreten des Effektes der Downregulation zu rechnen ist.
7 Summary
The present experiments were designed to test for the possibility to induce a downregulation of pituitary GnRH-receptors and hence an inhibition of LH-secretion by application of a GnRH-active implant. By achieving such an effect a temporary hormonal castration could be obtained. The experiments were performed with groups of three beagle bitches, dosed with either 3.3, 6.6 or 13.2 mg of the GnRH analogon Buserelin in form of an implant. To characterise availability of LH, time windows were set; each window consisted of a period of 360 min where blood samples were taken in 20 min intervals. In parallel single blood samples were taken, timing was according to the expected release of LH, initially in hourly intervals and finally in 20 day intervals. To eliminate likely negative feedback mechanisms of ovarian hormones, the experiments were performed with ovariohysterectomised bitches. As controlled by determinations of progesterone concentrations, ovariohysterectomy was carried out during dioestrus. Following ovariohysterectomy all dogs exhibited an increased availability of LH as an indication of an intact hypothalamus-pituitary-gonadal axis. The bitches served as their own controls. That is two time windows were placed prior to implantation, time windows after implantation were 14, 28 and 42 days afterwards, followed by time windows in 4-week-intervals until end of the experiment. By definition end of the experiment was the reaching of LH-levels as observed prior to implantation.
As determined by the area under the curve (AUC) and LH-basal concentrations, availability of LH was significantly reduced (p<0.0001) 14 days after implantation. No changes were observed in respect to the number of LH-pulses and their amplitude. A respective effect was observed in the single blood samples collected. There were no dose effects and when measured from the time of implantation, downregulation lasted for an average of 238 days. The availability of LH as determined during downregulation must be considered as a basal secretion since it was lower when compared to the availability as observed during dioestrus, that is when ovarian steroids exhibit a maximum negative feedback action.
The single blood samples taken show a significant increase of LH during the first hours after implantation. Depending on the stage of the reproductive cycle this increase must be considered responsible for the induced oestrus observed in previous studies. From this observation it is concluded, that a treatment with a GnRH-active implant to achieve downregulation must be placed in the first trimester of dioestrus making use of the already existing feedback action of ovarian steroids. By this the first 14 critical days until achievement of downregulation could be overcome.
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