4. Ergebnisse
4.2 Unilaterale Ureterobstruktion (UUO)
Die folgenden Daten beruhen auf vier voneinander unabhängig durch-geführten Versuchsdurchgängen mit jeweils 2-3 FVB-Mäusen pro Versuchsgruppe.
Tabelle 6: Gesamtgruppengröße nach vier voneinander unabhängigen Versuchsdurchgängen
Versuchsgruppe Anzahl der Mäuse
Schein-OP 6
UUO ohne Therapie 9
UUO unter 2 mg Compound 21/kg Futter 11 UUO unter 10 mg Compound 21/kg Futter 11 UUO unter 30 mg Compound 21/kg Futter 11 UUO unter 100 mg Compound 21/kg Futter 11
8:00
20:00 0
5 10 15 20
C21-Plasmaspiegel [nM]
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 1
10 100 1000
C21-Plasmaspiegel [nM]
Die Mortalität betrug in allen vier Versuchsdurchgängen 0 %.
Lediglich eine Maus musste nachträglich aus der Wertung genommen werden, da die unilaterale Ureterobstruktion nicht erfolgreich war. Bei dieser Maus waren weder makroskopisch noch histologisch Anzeichen eines Harnaufstaus erkennbar. Zudem war weder auf mRNA-Ebene noch histologisch eine UUO-bedingte Inflammation oder Fibrose nachweisbar.
4.2.1 Dosis-Wirkungs-Kurve
Da bislang keine Daten zur oralen Applikation von Compound 21 (C21) bei Mäusen bekannt sind, wurde zunächst eine Dosis-Wirkungskurve erstellt. Die Bestimmung der Plasmaspiegel erfolgte nach zweiwöchiger Therapie.
Mit steigender Dosis des AT2-Agonisten C21 steigen die Plasma-spiegel an.
Abb. 14: Dosisabhängige C21-Plasmaspiegel in [nM].
4.2.1.1 Die ideale Dosis
Gemäß pharmakologischen Überlegungen liegt die ideale Dosis eines Medikaments vor, wenn im Serum der 10-fache Wert der Bindungs-konstanten Ki vorhanden ist. Der AT2-Agonist Compound 21 hat eine Ki
von 0,4 nM [12], so dass die C21-Plasmaspiegel idealerweise 4 nM betragen sollten. Somit entspricht eine Dosis von 2 mg C21/kg Futter der idealen Dosis, bei der am ehesten ein Effekt zu erwarten ist.
4.2.2 Körpergewicht
Das Körpergewicht der gleichaltrigen, männlichen FVB-Mäuse wurde am Tag der Randomisierung in die sechs verschiedenen Versuchsgruppen, am Tag der unilateralen Ureterobstruktion und am Tag der Organ-entnahme zur Verlaufskontrolle bestimmt.
Tabelle 7: Durchschnittliches Körpergewicht (KG) bei Therapiebeginn, bei der unilateralen Ureterobstruktion und bei der Organentnahme in [g] ± SEM
Therapiebeginn UUO Organentnahme
Schein-OP 29,2 ± 0,8 29,8 ± 0,6 30,1 ± 0,6 ohne Therapie 28,8 ± 0,6 29,6 ± 0,8 28,4 ± 0,4 2 mg C 21 28,3 ± 0,3 29,3 ± 0,4 27,7 ± 0,6 10 mg C 21 29,9 ± 1,0 30,7 ± 1,0 28,2 ± 1,3 30 mg C 21 29,1 ± 1,4 28,7 ± 1,9 28,8 ± 1,1 100 mg C 21 29,3 ± 0,7 30,0 ± 0,6 28,7 ± 0,6
4.2.3 Retentionsparameter
Die laborchemische Bestimmung der Retentionsparameter im Plasma ermöglicht lediglich eine Aussage über die Funktion der kontralateralen Niere ohne Ureterobstruktion. Sollten die Kreatinin- und Harnstoff-N-Werte im Modell der unilateralen Ureterobstruktion unter der Therapie mit dem neuen selektiven AT2-Agonisten Compound 21 signifikant ansteigen, so würde dies auf einen nephrotoxischen Effekt hinweisen.
Da anhand der Retentionsparameter weder die Funktion noch die Regeneration der UUO-Niere beurteilt werden kann, sind lediglich die Kreatinin- und Harnstoff-N-Werte des Hauptversuches und der Positiv-kontrolle zum Ausschluss einer nephrotoxischen Wirkung der jeweiligen Medikamente aufgeführt.
Die Kreatinin-Bestimmung erfolgt mit dem „Autoanalyzer“ Hitatschi 717 der Firma Roche für humanes Plasma. Kreatininwerte unter der von Roche angegebenen Nachweisgrenze von 0,2 mg/dl können folglich nur als Anhaltspunkt für den wahren Kreatininwert dienen.
Bezogen auf die Gruppe ohne Therapie führt keine der vier Dosen des selektiven AT2-Agonisten Compound 21 zu einer signifikanten Erhöhung oder Reduktion der Krea-tininwerte nach UUO.
Abb. 15: Plasmakreatinin in [mg/dl], *p < 0,05.
Bezogen auf die Gruppe ohne Therapie führt keine der vier Dosen des selektiven AT2-Agonisten Compound 21 zu einer signifikanten Erhöhung oder Reduktion der Harn-stoffwerte nach UUO.
Abb. 16: Plasmaharnstoff-N in [mg/dl], p < 0,001.
Kreatinin
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0.0
0.1 0.2 0.3 0.4
*
[mg/dl]
Harnstoff-N
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
20 40 60 80
***
[mg/dl]
4.2.4 Relatives Nierengewicht
Nach 7-tägiger UUO ist
das relative Gewicht der kontralateralen Niere ohne Hydronephrose signifikant erhöht.
Keine der vier C21-Dosen führt zu einer Gewichtsreduktion.
Abb. 17: Gewicht der kontralateralen Niere ohne Hydronephrose bezogen auf das Körperge- wicht bei Organentnahme in [mg Niere/kg KG],
***p < 0,001.
Nach 7-tägiger UUO ist das relative Gewicht der hydronephrotischen UUO-Niere signifikant erhöht.
Keine der vier C21-Dosen führt zu einer Gewichtsreduktion.
Abb. 18: Gewicht der hydronephrotischen UUO-Niere bezogen auf das Körpergewicht bei Organ- entnahme in [mg Niere/kg KG], ***p < 0,001.
kontralaterale Niere ohne Hydronephrose
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
5 10 15
***
relatives Nierengewicht [mg Niere/kg KG]
UUO-Niere mit Hydronephrose
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
5 10 15
***
relatives Nierengewicht [mg Niere/kg KG]
4.2.5 Verbreiterung des Interstitiums
Die Zunahme des Interstitiums ist ein sehr gut objektivierbarer Parameter einer Nierenschädigung. Da die Grundstruktur des Interstitiums aus Bindegewebe besteht und nicht direkt zur Organfunktion beiträgt, geht eine Zunahme des Interstitiums mit einer Einschränkung der Nieren-funktion einher.
Abb. 19: PAS-Färbung histologischer Schnitte bei 200-facher Vergrößerung.
A: Schein-OP, B: ohne Therapie, C: 2 mg Compound 21 (C 21)/kg Futter, D: 10 mg C 21, E: 30 mg C 21, F: 100 mg C 21.
A
B
C
D
E F
Nach 7-tägiger UUO ist der prozentuale Anteil des Interstitiums der UUO-Niere signifikant vergrößert.
Die Therapie mit 2 mg C21/kg Futter senkt die Zunahme mit p < 0,01 signifikant. Der Anteil des Interstiums beträgt 6 % weniger als bei den UUO-Mäusen ohne Therapie.
4.2.6 Fibrose
Das Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1-Protein (PAI-1) gehört zum Typ der Serin-Protease-Inhibitoren. Es reguliert durch die Hemmung des gewebespezifischen Plasminogen-Aktivators (t-PA) und des Urokinase-Plasminogen-Aktivators (u-PA) Fibrinolyse und Proteolyse und dient als Fibrosemarker [36].
Nach 7-tägiger UUO ist die relative Expression von PAI-1 in der UUO-Niere signifikant erhöht.
Keine der vier Dosen des selektiven AT2 -Agonisten Compound 21 reduziert diesen Anstieg.
Abb. 21: Relative mRNA-Expression von PAI-1, Interstitium
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
20 40 60 80
**
***
Anteil [%]
PAI-1
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
100 200 300
**
relative PAI-1-Expression
Abb. 20: Interstitiumanteil pro Nierenschnitt in [%],
**p < 0,01, ***p < 0,001.
A
B
C D
E F
4.2.7 Monozyten
Durch die histologische Färbung des F4/80-Antigens, einem 160 kD großen Glykoprotein, welches von murinen Makrophagen exprimiert wird, kann man die Anzahl der eingewanderten Makrophagen pro Gesichtsfeld ermitteln.
Abb. 22: F4/80-Färbung histologischer Schnitte bei 400-facher Vergrößerung.
A: Schein-OP, B: ohne Therapie, C: 2 mg Compound 21 (C 21) D: 10 mg C 21, E: 30 mg C 21, F: 100 mg C 21.
Die Auswertung erfolgt bei 400-facher Vergrößerung mithilfe eines Zählrasters. Pro Schnitt wurden 20 Gesichtsfelder mäanderförmig im Bereich des Nierenkortex ausgezählt.
Nach 7-tägiger UUO ist die Anzahl eingewander-ter F4/80-positiver Zellen in der UUO-Niere signifi-kant erhöht.
Keine der vier C21-Dosen führt zu einer signifikanten Reduktion.
Die lokale Ausschüttung des proinflammatorischen Chemokins Monocyte chemoattractant Protein-1 (kurz MCP-1 oder auch CCL2 genannt) führt zur Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen über deren CCR2-Rezeptor und dient somit als indirekter Monozyten-Marker [37-38].
Nach 7-tägiger UUO ist die relative Expression von MCP-1 in der UUO-Niere signifikant erhöht.
Die Therapie mit 2 und 10 mg C21/kg Futter führt lediglich zu einer marginalen, aber nicht signifikanten Reduktion.
Abb. 24: Relative mRNA-Expression von MCP-1 im Kortex der UUO-Niere, ***p < 0,001.
Abb. 23: Durchschnittliche Anzahl F4/80-positiver Zellen pro Raster, ***p < 0,001.
MCP-1 (CCL2)
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
500 1000 1500 2000
***
relative MCP-1-Expression
F4/80
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
50 100 150 200 250
***
Anzahl F4/80-positiver Zellen
4.2.8 T-Zellen
Das CD3-Antigen, ein transmembranöser Protein-Komplex, der mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR) und der zeta-Kette den so genannten TCR-CD3-Komplex bildet, dient als T-Zell-Parameter.
Histologisch kann das CD3-Antigen durch die CD3-Färbung sichtbar gemacht werden und eine direkte Aussage über die Anzahl der eingewanderten CD3-positiven T-Zellen im Nierenkortex geben. Die Anzahl korreliert mit der Schwere der UUO-bedingten Inflammation.
Abb. 25: CD3-Färbung histologischer Schnitte bei 200-facher Vergrößerung.
A: Schein-OP, B: ohne Therapie, C: 2 mg Compound 21 (C 21) D: 10 mg C 21, E: 30 mg C 21, F: 100 mg C 21.
A
B
C D
E F
Nach 7-tägiger UUO ist die Anzahl von einge-wanderten CD3-positiven Zellen in der UUO-Niere signifikant erhöht.
Verglichen mit der nicht therapierten Versuchs-gruppe senkt keine der vier C21-Dosen den UUO-bedingten Anstieg CD3-positiver Zellen.
Das Interferon induzierbare Protein 10 (IP-10, oder auch CXCL10 genannt) ist ein Chemokin, welches aktivierte T-Zellen über deren hoch exprimierten CXCR3-Rezeptor rekrutiert [39]. Somit handelt es sich um einen indirekten Parameter, der einen Rückschluss auf die Anzahl eingewanderter T-Zellen erlaubt.
Nach 7-tägiger UUO ist die relative Expression von IP-10 in der UUO-Niere signifikant erhöht.
Unter 2 mg C21/kg Futter ist dieser UUO-bedingte Anstieg zwar tendenziell, jedoch nicht signifikant geringer.
Abb. 27: Relative mRNA-Expression von IP-10 im Kortex der UUO-Niere, ***p < 0,001.
CD3
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
50 100 150 200
***
Anzahl CD3-positiver Zellen
IP-10
Schein-OP
ohne Therapie (UUO) 2 mg
C21 (UUO) 10 mg
C21 (UUO) 30 mg
C21 (UUO) 100 mg
C21 (UUO) 0
10 20 30 40
***
relative IP-10-Expression
Abb. 26: Durchschnittliche Anzahl CD3-positiver Zellen pro Raster, ***p < 0,001.